Lg-Flo1蛋白N端的誘導表達及活性研究

謝瑩，李曉敏，蔡國林1,,4*，陸健1,,4*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林，132022) 3(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 4(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

酵母絮凝是指酵母細胞間相互作用，從懸浮的培養基中快速沉降的現象[1]。這也是細胞抵御外界惡劣環境的一種表現形式[2-4]。絮凝表型分為Flo型和New Flo型[5]。Flo型絮凝表現在發酵的各個時期，會造成發酵時間延長，而New Flo型絮凝只有糖質量濃度<3 g/L時才能開始表達[6]。在啤酒發酵過程中，通常希望在發酵結束時，發酵液中分散的酵母細胞能相互聚集而沉淀，New Flo型酵母正是發酵工業所需要的，這對酵母細胞分離、回收再利用具有重要的作用[7-9]。

New Flo型基因表達的Lg-Flo1絮凝蛋白和Flo1絮凝蛋白相似，都是由N端、C端和中間重復序列3個結構域組成的細胞壁蛋白，這些蛋白的C端以共價鍵連接到細胞壁上，利用暴露的N端與相鄰酵母細胞壁的甘露糖殘基特異性結合導致絮凝[10-11]。除了甘露糖可以可逆地抑制這種表型外，Lg-Flo1蛋白還受多種糖的抑制，如葡糖糖、麥芽糖、麥芽三糖等[12]。GOOSSENS等[13]將Flo1絮凝蛋白的N端在畢赤酵母中的表達、純化，產量是在釀酒酵母中表達的4倍，并且具有與甘露糖結合的活性。GROES等[14]將純化出的Lg-Flo1蛋白結晶，進一步通過X-ray衍射分析確定了其糖結合區域。然而，國內尚未有關絮凝蛋白Lg-Flo1的克隆、表達及純化的相關報道。

本研究將巴氏酵母的New Flo型基因Lg-FLO1的N端序列克隆到pET-28a(+)載體上，選擇不同的誘導條件在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達，經純化、復性后的Lg-Flo1蛋白表現出類似的甘露糖結合活性。為大規模制備絮凝蛋白并進一步探索其與不同低聚糖或糖蛋白的結合位點及空間結構，從而以此蛋白為配基制備功能性糖的特異性親和吸附劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌BL21(DE3)，本實驗室保存；pETLF1重組表達質粒，由金唯智生物科技有限公司合成，連接pET-28a(+)質粒載體，轉化至大腸桿菌JM109中保存。

1.2 培養基及主要試劑

LB培養基、TB培養基、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ：TaKaRa公司；Ni-NTA Agarose：QIAGEN公司；過硫酸銨：阿拉丁；蛋白質Marker：BBI生命科學有限公司；丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺30%溶液、尿素、乳糖、IPTG、卡那霉素、牛血清蛋白、考馬斯亮藍和咪唑：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 重組表達質粒的鑒定

質粒的提取參照試劑盒說明書進行，重組表達質粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，核酸電泳檢測目的條帶。

1.4 重組表達質粒的轉化及陽性轉化子篩選

將重組表達質粒pETLF1轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布含有Amp的LB平板，培養12 h，挑取單菌落。從目的基因上任意位置選擇長度為252 bp的序列，用Primer Premier 5軟件設計引物，菌落PCR篩選陽性轉化子。大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化方法參考《分子生物學實驗》執行[15]。

1.5 N-Lg-Flo1蛋白在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE分析

將BL21(DE3)(pETLF1)菌液在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基上劃線培養24 h，挑取單菌落接種于3 mL含有相同濃度卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養12 h，以1%的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養基中， 37 ℃、200 r/min培養至對數生長期(OD600值0.6)，在培養基中添加乳糖(終質量濃度為0.2 g/L)，37 ℃、200 r/min 誘導8 h，取5 mL菌液，離心收集菌體，用3 mL、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重懸菌體，超聲波破碎菌體(350 W工作20 min，2 s/2 s)。將菌體破碎液進行SDS-PAGE分析，方法參照《生物化學實驗》執行[16]。

1.6 誘導條件對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

1.6.1 誘導劑對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養基中，分別采用終質量濃度為0.2 g/L的乳糖和0.2 mmol/L的IPTG作為誘導劑，37 ℃、200 r/min誘導8 h，以下方法均按照1.5所述方法獲得菌體破碎液，進行SDS-PAGE分析。以乳糖誘導的BL21(DE3) (pET-28a(+))破碎液作為對照。

1.6.2 培養基對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

將菌液以相同的接種量分別接種于30 mL含有卡那霉素的LB和TB培養基中，乳糖為誘導劑，37 ℃、200 r/min誘導8 h，菌體超聲破碎后進行SDS-PAGE分析。

1.6.3 誘導溫度對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養基中，乳糖為誘導劑，分別在25、28和37 ℃、200 r/min誘導8 h，菌體超聲破碎后進行SDS-PAGE分析。

1.6.4 誘導時間對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養基中，乳糖為誘導劑，37 ℃、200 r/min分別誘導2、4、6、8、10 h，菌體超聲破碎后進行SDS-PAGE分析。

1.6.5 誘導劑用量對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

將菌液以相同的接種量接種于30 mL含有卡那霉素的LB培養基中，加入乳糖誘導，使乳糖終質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L，37 ℃、200 r/min誘導8 h，菌體超聲破碎后進行SDS-PAGE分析。

1.7 包涵體N-Lg-Flo1蛋白的變性溶解、純化及復性

將BL21(DE3)(pETLF1)在優化后的誘導條件下誘導表達，離心收集菌體，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗滌菌體后重懸，超聲波破碎，離心收集沉淀，得到重組蛋白包涵體。用洗滌緩沖液洗滌沉淀2次，再加入變性緩沖液，4 ℃攪拌5 h后，離心去除沉淀，上清為N-Lg-Flo1包涵體變性液。使用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析帶有His-tag的N-Lg-Flo1蛋白，用咪唑濃度梯度洗脫目的蛋白，純化步驟及溶液配制參照Ni-NTA瓊脂糖凝膠產品說明書中包涵體蛋白的純化。純化的蛋白進行SDS-PAGE分析。蛋白的復性參照文獻的方法執行[17-18]。

1.8 蛋白含量的測定

采用Q5000超微量核酸蛋白測定儀測定蛋白的紫外吸收值及質量濃度。

1.9 熒光光譜分析

通過熒光光譜測定N-Lg-Flo1蛋白與D-(+)-甘露糖的結合作用。設定激發波長為277 nm，在300～420 nm掃描發射波長，掃描速度為100 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為5 nm[1]，確定最大發射波長。初始樣品為500 μL絮凝緩沖液(50 mmol/L醋酸鈉，pH 6，100 mmol/L NaCl，7 mmol/L CaCl2)中含有2 μmol/L的N-Lg-Flo1蛋白，測定熒光信號強度。之后加入D-(+)-甘露糖，使終濃度為100 mmol/L，再次測定熒光信號強度。熒光強度變化如公式(1)：

熒光強度變化%=

(1)

數據采用SPSS 17.0分析，重復3次實驗取平均值，在圖中以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析數據差異的顯著性(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體pETFL1的鑒定

將N-Lg-FLO1基因克隆到pET-28a(+)質粒載體上，構建了重組表達載體pETFL1，N-Lg-FLO1基因長度為642 bp，位于BamH Ⅰ (198) /Hind Ⅲ (173) 位點，pETFL1載體結構如圖1所示。從菌株JM109(pETFL1) 提取質粒pETFL1，經BamH Ⅰ /Hind Ⅲ酶切鑒定，證實了重組質粒含有N-Lg-FLO1基因片段(圖2)。

圖1 pETLF1表達載體結構Fig.1 The expression vector structure of pETLF1

圖2 pETLF1表達載體酶切鑒定Fig.2 The identification of the expression vector pETLF1 by restriction endonucleases digestion注：M-DNA marker；1-BamH Ⅰ/Hind Ⅲ酶切。

2.2 重組表達質粒的轉化及陽性轉化子檢測

重組表達質粒pETLF1轉化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布Amp平板，挑取單菌落，進行PCR檢測，獲得陽性轉化子。PCR檢測結果見圖3，從電泳圖中可以看到，從Amp平板上挑取的8個轉化子均擴增出設計的含有252 bp的目的條帶，均為陽性克隆。將其接種于含有Amp的LB液體培養基中，甘油保藏，用于目的蛋白的表達。

圖3 陽性轉化子檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of validation of positive transformant注：M-DNA marker；1-陽性對照；2～9-轉化子PCR檢測條帶。

2.3 誘導劑和培養基對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

分別使用IPTG和乳糖做誘導劑誘導重組大腸桿菌表達目的蛋白(圖4-A)，用Bio-Rad凝膠成像儀的Image Lab軟件MW分析工具對目的蛋白分子質量分析，約為2.8 kDa，比實際預測的分子質量高出約0.4 kDa，因為表達了載體上的一些標簽。通過Image Lab軟件檢測泳道和條帶，在定量工具中選擇每個泳道的目的蛋白條帶為參考條帶，分析得到目的蛋白條帶百分比含量。結果表明，表達目的蛋白分別占總蛋白的30.7%和29.5%，表明使用IPTG和乳糖為誘導劑時表達的目的蛋白相對含量接近。IPTG不能被菌體利用，也不會產生復雜的代謝過程，被用作常規誘導劑廣泛使用，但價格較高，且對菌體有毒害作用，因此限制了在大規模生產中的應用。而乳糖作為誘導劑參與代謝，需要乳糖透過酶的協助進入菌體內部，乳糖被轉運至胞內后還需要經過β-半乳糖苷酶作用轉化為異乳糖才能誘導Lac啟動子，所以與IPTG相比，乳糖誘導過程更為復雜，但其經濟、無毒，特別是在大腸桿菌基因工程菌大規模發酵中具備較大潛在價值[19]。

在LB和TB培養基中表達的結果如圖4-B所示，TB培養基營養豐富，雖然表達后菌體濃度較大，總蛋白量高，但雜蛋白所占的比例較大，Image Lab軟件分析結果表明目的蛋白只有19.3%，而在LB培養基中目的蛋白占30.3%，表達量較高。

2.4 誘導溫度對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

分別在25、28 和37 ℃對目的蛋白進行誘導表達(圖5)，通過Image Lab軟件分析得出，在37 ℃表達的目的蛋白占總蛋白的31.9%，而在25和28 ℃表達的目的蛋白僅占12.5%和16%。可見溫度對目的蛋白的表達量影響較大，與許崇利[19]用pET-28c(+)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達β2毒素的結果一致，推測pET-28系列載體的適合誘導表達溫度為37 ℃。

A-誘導劑對蛋白表達的影響;B-培養基對蛋白表達的影響圖4 不同誘導劑和培養基對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響Fig.4 Effects of different inducer and medium on expression of N-Lg-Flo1 protein注：黑色箭頭所指條帶為目的蛋白;M-蛋白質Marker。下同。圖A中，1- BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～3- IPTG和乳糖誘導的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液；圖B中：1～2- BL21(DE3)(pETLF1)在LB和TB培養基中的菌體裂解液。

圖5 不同誘導溫度對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響Fig.5 Effects of different induction temperature onexpression of N-Lg-Flo1 protein注：1- 37 ℃培養BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～4- 25、28和37 ℃誘導的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液。

2.5 誘導時間對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

誘導2 h，菌體濃度較低，目的蛋白還沒有表達，隨著誘導時間的增加，目的蛋白開始大量表達(圖6)，Image Lab軟件分析表明，誘導6 h后，目的蛋白占總蛋白的比例相差不明顯，在30%～33%。為了便于細胞破碎且節省成本，可以選擇誘導時間為6 h。

圖6 不同誘導時間對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響Fig.6 Effects of different induction time on expression of N-Lg-Flo1 protein注：1-BL21(DE3)(pET-28a(+))誘導8h的菌體裂解液；2～6-BL21(DE3)(pETLF1)誘導2、4、6、8和10 h的菌體裂解液。

2.6 乳糖加入量對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響

誘導劑的加入量對菌體總蛋白量和目的蛋白的表達量影響不大(圖7)，Image Lab軟件分析表明，目的蛋白所占的相對比例在30%～32%，相差很小，因此選擇加入0.2 g/L的乳糖進行誘導，可以降低成本。

圖7 乳糖加入量對N-Lg-Flo1蛋白表達的影響Fig.7 Effects of different lactose concentrationson expression of N-Lg-Flo1 protein注：1-0.2 g/L乳糖誘導的BL21(DE3)(pET-28a(+))菌體裂解液；2～6- 0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L乳糖誘導的BL21(DE3)(pETLF1)菌體裂解液。

2.7 N-Lg-Flo1蛋白的純化

利用pET-28a(+)表達載體上的His-tag的親和性，用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和柱對表達的N-Lg-Flo1包涵體蛋白變性液進行分離純化，洗脫曲線如圖8所示，第1個洗脫峰為沒有和親和柱結合的雜蛋白峰，第2個洗脫峰為目的蛋白的洗脫峰，較為單一，150 mmol/L的咪唑可以將目的蛋白洗脫下來。將洗脫峰對應的洗脫液進行SDS-PAGE分析(圖9)，雜蛋白被大量除去，目的蛋白的純度可以達到90%以上。通過Image Lab軟件分析及超微量核酸蛋白測定儀測得的蛋白濃度，計算得到目的蛋白的回收率約為88%。

圖8 N-Lg-Flo1蛋白親和層析洗脫曲線Fig.8 Affinity chromatography elution curve of N-Lg-Flo1 protein

圖9 Ni-NTA親和柱純化后SDS-PAGEFig.9 SDS-PAGE of proteins purified by Ni-NTA affinity column注：1- 包涵體蛋白變性溶解液；2～5- 雜蛋白；6～8- 目的蛋白

2.8 N-Lg-Flo1蛋白的甘露糖結合活性

通過熒光光譜測定N-Lg-Flo1蛋白與甘露糖的結合活性，通過對目的蛋白溶液的波長掃描，確定最大激發波長和最大發射波長分別為275 nm和336 nm，在此波長下，進行熒光強度的測定。如圖10所示，添加100 mmol/L甘露糖的蛋白溶液和沒有添加甘露糖的蛋白溶液相比，熒光淬滅，信號強度減弱了25%，表明N-Lg-Flo1蛋白存在與甘露糖的結合位點，結合部位的氨基酸可能為Trp、Phe或Tyr。KOBAYASHI等[20]的研究推測Flo1蛋白的第228位Trp是甘露糖的一個結合位點，而Lg-Flo1蛋白的228位被Leu取代，推測甘露糖結合位點可能為196位的Trp。

圖10 N-Lg-Flo1蛋白與甘露糖結合熒光強度變化Fig.10 Change in fluorescence intensity by the binding of D-(+)-mannose to N-Lg-Flo1 protein

3 結論

將巴氏酵母絮凝蛋白基因Lg-FLO1的N端序列克隆到pET-28a(+)載體上，構建了重組表達載體pETLF1，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。通過對菌體破碎液進行SDS-PAGE和Image Lab軟件分析，確定了較優的誘導表達條件：在LB培養基中表達，乳糖作為誘導劑，乳糖終質量濃度0.2 g/L，誘導溫度37 ℃，誘導時間6 h，目的蛋白的表達量均高于30%。該結果與其他使用乳糖作為誘導劑的科研人員的研究結果相似，采用乳糖誘導時,目標蛋白在總蛋白中所占比例與IPTG誘導相當，甚至酶的活性更高[19,21-22]。對包涵體目的蛋白變性溶解后，經Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和柱分離純化，目的蛋白的純度可以達到90%以上，回收率約為88%。熒光光譜分析表明，復性后的目的蛋白與100 mmol/L的甘露糖作用，熒光信號強度減弱了25%，表明N-Lg-Flo1蛋白具有與甘露糖的結合活性。