長鏈非編碼RNA H19靶向miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥反應

王少霞

(河南科技大學第三附屬醫院心內科，河南 洛陽 471003)

長鏈非編碼(Lnc)RNA是一類不同的非蛋白質編碼轉錄物，在各種生物過程中發揮重要作用〔1,2〕。由LncRNA調節的這些生物學過程包括侵襲、轉移、細胞凋亡、血管生成、microRNA沉默、胚胎發育、心臟衰老和腫瘤發展〔3～6〕。有研究報道，LncRNA UCA1通過抑制p27表達促進心肌細胞凋亡〔7〕。IncRNA H19是一種從H19基因轉錄的LncRNA，在胎兒的幾種組織中高表達，但出生后表達顯著降低〔8,9〕。有研究報道了H19相互矛盾的功能，特別是在癌癥中〔10～12〕。H19在細胞損傷中的作用研究有限，其在大鼠血管平滑肌細胞損傷后表達異常，但在心肌細胞損傷中的作用及機制尚未清楚。本研究擬以脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞H9c2為研究對象，檢測過表達H19、敲減miR-194-5p、過表達miR-194-5p對H9c2細胞炎癥因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1材料 心肌細胞H9c2購自ATCC；噻唑藍(MTT)、脂質體LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒、膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)雙染色法凋亡檢測試劑盒購于Takara公司；DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒、白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒、IL-1β檢測試劑盒均購自北京萊寶公司。

1.2LPS誘導的心肌細胞損傷模型 參照龐斯斯〔13〕的方法進行改良，將心肌細胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培養液，待細胞融合度達80%時，將含有LPS(100 ng/ml)的DMEM 培養液處理24 h。

1.3細胞轉染 Control組：不做任何處理的H9c2細胞。LPS組：按照1.2方法處理的H9c2細胞。將pc-con、pc-H19、anti-miR-con、anti-miR-194-5p、pc-H19+miR-con、pc-H19+miR-194-5p按照脂質體LipofectamineTM2000轉染至H9c2細胞，然后按照1.2方法進行處理，分別標記為pc-con組、pc-H19組、anti-miR-con組、anti-miR-194-5p組、pc-H19+miR-con組、pc-H19+miR-194-5p組。將上述各組細胞用于后續實驗。

1.4qRT-PCR實驗 取適量對數生長期1.3各組細胞，嚴格按照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書進行miR-194-5p、LncRNA H19檢測。用2-△△Ct計算miR-194-5p、LncRNA H19的表達。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 按照TNF-α、IL-6、IL-1β檢測試劑盒說明書檢測各組細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測實驗 熒光素酶報告載體(psiCHECK2-H19-WT,psiCHECK2-H19-MUT)分別與miR-194-5pmimics、miR-NC用脂質體法轉染24 h細胞，培養5 h后，更換新鮮培養液繼續培養，轉染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作。結果以海腎熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR-194-5p與H19的結合力。

1.7統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1LPS誘導心肌細胞中LncRNA H19和miR-194-5p的表達 與Control組(1.02±0.14、1.06±0.16)相比，LPS組心肌細胞中LncRNA H19表達(0.43±0.11)顯著降低，miR-194-5p表達(2.58±0.22)顯著升高(t=5.740、9.678，P=0.005、0.001)。

2.2LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的分泌 與Control組相比，LPS組心肌細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著升高(均P<0.05)，見表1。

2.3過表達LncRNA H19抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌 與pc-con組相比，pc-H19組心肌細胞中LncRNA H19表達顯著升高，TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著降低(均P<0.05)，見表2。

2.4敲減miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌 與anti-miR-con組相比，anti-miR-194-5p組心肌細胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表1 LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌

表2 過表達LncRNA H19抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌

表3 敲減miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌

2.5LncRNA H19靶向miR-194-5p 運用miRcode數據庫預測到miR-194-5p與H19存在結合位點(圖1)；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-con組(0.98±0.09)相比，miR-194-5p組WT-H19細胞的熒光活性(0.31±0.04)顯著降低；與pcDNA組(1.00±0.09)相比，pcDNA-H19組細胞中miR-194-5p表達(0.36±0.05)顯著降低；與si-con組(0.94±0.11)相比，si-H19組(3.16±0.25)顯著升高(均P<0.05)，且4組差異有統計學意義(F=214.122,P=0.000)。

2.6過表達miR-194-5p逆轉了過表達LncRNA H19對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用 與pc-con組(1.02±0.10)相比，pc-H19組心肌細胞中miR-194-5p表達(0.42±0.06)顯著降低(P<0.05)；與pc-H19+miR-con組相比，pc-H19+miR-194-5p組心肌細胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著升高(均P<0.05)。

見表4。

圖1 LncRNA H19中含有與miR-194-5p互補的核苷酸序列

表4 過表達miR-194-5p對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用

3 討 論

研究表明，LncRNA 可作為一種競爭性的內源性 RNA 與非編碼miRNA交互作用，共同參與靶向基因的調控，對腫瘤發生與發展過程產生重要影響〔14,15〕。同時，miRNA通過大量蛋白質編碼基因靶向調控LncRNA的表達，miRNA和LncRNA在調節細胞過程均有重要作用〔16〕。越來越多的證據表明，LncRNA和miRNA在心肌缺血和再灌注(I/R)損傷的發病機制中起重要作用〔17,18〕。Gong等〔17〕發現，缺氧誘導H9c2細胞活力、遷移和侵襲下降，細胞凋亡增加，H19上調，且敲低H19增加了H9c2細胞中的缺氧誘導的損傷，miR-139的表達與H19呈正相關，上調miR-139可加重缺氧誘導的損傷，另外，Sox8被鑒定為miR-139的靶標，其表達受miR-139的負調控，表明Sox8的過表達可能通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)來減少缺氧誘導的細胞損傷，提示H19通過miR-139介導的Sox8上調及PI3K/ AKT/ mTOR途徑和MAPK的激活來減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷。Luo等〔18〕研究發現，H19和miR-675在缺血再灌注的心肌細胞中上調，且敲除H19可增加細胞活力，減少細胞凋亡，減少炎癥細胞因子(IL-1β、TNF-α 和IL-6)，抑制氧化應激，下調p-IκB-α 和p-p65，并上調Nrf2和HO的表達，且miR-675的過表達可部分逆轉這些作用，此外過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α 是miR-675的靶基因，且H19通過miR-675負調節PPARα表達，抑制PPARα、miR-675或H19可部分逆轉對細胞功能(細胞凋亡、炎癥和氧化應激)的抑制作用，另外，在心肌I/R小鼠模型中，H19的敲低可明顯減少梗塞面積，增加左心室收縮壓，并降低左心室舒張末期壓力，表明抑制H19保護心臟免受心肌I/R損傷，其機制可能與調節miR-675/PPARα 通路有關。本研究發現，H19在損傷的H9c2細胞中低表達，且過表達H19可抑制H9c2細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，進一步深入研究發現，LncRNA H19靶向負調控miR-194-5p。

miRNA參與很多疾病的發生發展，如肺損傷、心臟損傷及各種癌癥〔19〕。據調查miR-194-5p在肝癌、胃癌、腎癌、膠質瘤中均可發揮調控作用〔20～23〕。Xie等〔24〕報道，LPS處理的人成纖維細胞WI38可降低細胞活力，促進凋亡細胞，上調p-65、Bcl-3的表達，下調IκBα，且抑制miR-194可進一步增強LPS對細胞活力和細胞凋亡的影響，過表達miR-194可明顯逆轉LPS對細胞活力、細胞凋亡及關鍵蛋白p-65、Bcl-3、IκBα 的表達，揭示了miR-194通過抑制WI38細胞中核因子(NF)-κB途徑增加了LPS誘導的細胞活力抑制和細胞凋亡增加。Zhai等〔25〕報道，miR-194在LPS誘導的H9c2心肌細胞損傷模型中表達異常升高，且miR-194可靶向負調控Slc7a5，過表達Slc7a5可逆轉過表達miR-194對H9c2細胞的凋亡促進及激活Wnt/β-catenin通路作用，提示miR-194通過激活Wnt/β-catenin途徑促進心肌細胞凋亡并參與內毒素血癥誘導的心肌損傷。本研究發現，miR-194-5p表達異常升高，與Xie等〔24〕研究結果一致；深入研究發現，敲減miR-194-5p可抑制H9c2細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，過表達miR-194-5p可逆轉過表達H19對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用。

綜上，LncRNA H19可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥因子的分泌，其機制可能與靶向負調控miR-194-5p有關，為心肌損傷的治療提供理論依據。