miR-21可通過下調CCL20減輕心肌炎的炎性反應抑制心肌細胞凋亡

李陽春 張敏 雷蓉

(川北醫學院附屬醫院 1心血管內科，四川 南充 637000；2健康管理中心)

病毒性心肌炎(VMC)是由病毒侵襲心臟而引起心肌炎癥為主的心血管疾病〔1〕。該病可由多種病毒引起，其中有艾可(ECHO)病毒、柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組均可導致VMC，最常見的是由柯薩奇B組3型病毒(CVB3)引起的心肌病變，且其多發于青年和兒童〔2〕。病毒感染后會引起機體發生一系列的炎性反應，激活機體凋亡相關基因，誘導凋亡。該病的治療主要針對病毒感染和心肌炎癥。多數患者經治療后可痊愈，但仍有部分患者會在急性期死亡。微小(mi)RNA為一類長度在19～25個核苷酸的內源單鏈小分子RNA，其表達具有組織特異性〔3〕。研究顯示，miRNA在病毒與宿主細胞的相互作用中發揮重要用〔4〕。但miR-21在心肌炎細胞中的作用機制尚不清楚。人巨噬細胞炎性蛋白3α(CCL20)為CC家族趨化因子中重要的成員之一，與其他趨化因子不同，其受體為趨化因子受體(CCR)6分子，主要分布在樹突狀細胞(DC)、效應T細胞、記憶T細胞和B細胞表面〔5〕。研究顯示，CCL20在VMC患者中高表達〔6，7〕，但其具體的作用機制尚不完全清楚。本研究觀察過表達miR-21、沉默CCL20對心肌炎患者巨噬細胞中白細胞介素(IL)-17及心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 健康志愿者、心肌炎患者心肌細胞、心肌炎患者巨噬細胞購自ATCC；siNC、siCCL20、miR-21 mimics、pcDNA 3.1購自索萊寶公司；CCL20定量檢測試劑盒購自江蘇江萊公司；IL-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海鈺博公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自吉滿生物。

1.2細胞培養 用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基于37℃，5%CO2的培養箱中培養健康志愿者、VMC患者巨噬細胞，細胞生長至對數期用于實驗；用含10% FBS的DMEM培養基于37℃ 5%CO2的培養箱中培養健康志愿者、VMC患者心肌細胞，待細胞融合度達到70%～80%時，傳代培養，至第3～8代用于實驗。

1.3細胞轉染 將miR-21 mimimcs、miR-NC轉染至VMC患者巨噬細胞、心肌細胞，標記為miR-21 mimics組、miR-NC組，未做任何處理的VMC患者巨噬細胞、心肌細胞標記為NC組，siCCL20、siNC轉染至VMC患者巨噬細胞、心肌細胞標記為siCCL20組、siNC組，未做任何處理的VMC患者巨噬細胞、心肌細胞標記為NC組，將miR-21 mimics+pcDNA 3.1、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20轉染至VMC患者心肌細胞，標記為miR-21 mimics+pcDNA 3.1組、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20組，以上各組均采用脂質體法轉染，轉染成功后備用。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)實驗 將對數生長期1.3各轉染組細胞，用Trizol法提取細胞樣本總RNA，并定量。按照逆轉錄反應試劑盒說明書合成模板鏈cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作步驟要求進行miR-21的測定。反應結束后分析Ct值，以2-△△Ct法計算定量結果，測定miR-21的相對表達水平。每個樣品重復3次，取平均值。

1.5ELISA 按照CCL20定量檢測試劑盒、IL-17 ELISA檢測試劑盒檢測對數生長期1.3各組細胞中CCL20、IL-17的含量。

1.6Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗 將1.3各轉染組細胞，用結合緩沖液500 μl懸浮，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細胞儀分析測定結果：細胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.7雙熒光素酶報道基因檢測實驗 取適量對數生長期1.3各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，以psiCHECK2-CCL20-3′非翻譯區(UTR)野生型(WT)和psiCHECK2-CCL20-3′UTR突變型(MUT)的表達為對照，觀察miR-21對CCL20表達的影響。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-21和CCL20在VMC患者中的表達 與健康志愿者相比，VMC患者心肌細胞中miR-21表達顯著降低(P<0.001)，血清中CCL20的含量顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 miR-21和CCL20在VMC患者中的表達

2.2過表達miR-21對VMC患者巨噬細胞中IL-17 與NC組、miR-NC組相比，miR-21 mimics組miR-21表達顯著升高，IL-17含量顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)，見表2。

2.3沉默CCL20對VMC患者巨噬細胞IL-17水平及心肌細胞凋亡的影響 與NC組、siNC組相比，siCCL20組CCL20表達、IL-17水平、細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)，見表3。

表2 過表達miR-21下調VMC患者巨噬細胞IL-17水平、心肌細胞凋亡

與NC組比較：1)P<0.05；與miR-NC組比較：2)P<0.05

表3 沉默CCL20下調VMC患者巨噬細胞IL-17水平、心肌細胞凋亡

與NC組比較：1)P<0.05；與siNC組比較：2)P<0.05

2.4CCL20是miR-21的靶基因 通過TargetScan對miR-21和CCL20進行預測，發現miR-21和CCL20存在互補序列(圖1)。將CCL20-WT、CCL20-MUT轉染心肌細胞，標記為CCL20-WT組、CCL20-MUT組，未做任何處理的心肌細胞標記為NC組。與miR-NC組相比，轉染miR-21 mimics的CCL20-WT組心肌細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)。見表4。可見，CCL20是miR-21的靶基因。

圖1 CCL20的3′UTR中含有與miR-21互補的核苷酸序列

組別NCCCL20-WTCCL20-MUTmiR-NC組1.48±0.181.52±0.191.51±0.15miR-21 mimics組1.47±0.160.52±0.091.53±0.13t值0.0728.2390.175P值0.9460.0010.870

2.5過表達CCL20可逆轉miR-21對VMC患者心肌細胞凋亡的抑制作用 與miR-NC組〔(9.24±0.67)%〕相比，miR-21 mimics組細胞凋亡率〔(4.12±0.39)%〕顯著降低(P<0.05)；與miR-21 mimics+pcDNA 3.1組〔(3.97±0.26)%〕相比，miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20組細胞凋亡率〔(9.17±0.74)%〕顯著升高(P<0.05)。可見，過表達CCL20可逆轉miR-21對VMC患者心肌細胞凋亡的抑制作用。

3 討 論

miRNAs由一類小型非編碼RNA組成，可控制互補目標信使RNA表達〔8〕。miRNA在進化上高度保守，通過與靶基因3′UTR相結合從而抑制靶基因的翻譯或使其降解〔9〕。研究證實miRNA參與細胞的增殖、分化及凋亡等過程，與腫瘤、心臟等疾病的發生發展密切相關，在心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常和心力衰竭中均具有重要作用〔10〕。Thum等〔11〕在衰竭心臟成纖維細胞的研究中發現miR-21高表達，且沉默miR-21可通過失活胞外信號調節激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAP)抑制間質纖維化，減弱心臟功能，提示miR-21可作為心力衰竭疾病治療的靶點。何進等〔12〕在心肌炎的研究中構建CVB3誘導的VMC小鼠模型，并檢測模型小鼠心肌組織中10種miRNA的表達，揭示miR-92a、miR-126-5p、miR-199a、miR-210、miR-208表達上調，miR-21、miR-320表達下調，且這些異常表達的調控與心肌細胞周期、遷移、凋亡及血管生成均相關。本研究與前人研究結果相吻合，驗證了miR-21可靶向結合CCL20，且過表達CCL20可逆轉miR-21對VMC患者心肌細胞凋亡的抑制作用。

心臟受病毒侵襲后會引起一系列的病理生理變化，如氧化應激、能量代謝障礙、炎性因子的分泌、線粒體結構和功能的改變等，甚至發生心肌細胞凋亡、壞死〔13〕。心肌細胞為不可再生的終末分化細胞，因此在心臟病中可逆性的抑制心肌細胞凋亡將保護心肌細胞免受損，得益于心臟〔14〕。顏雯等〔15〕研究報道，在VMC中，心肌細胞的凋亡水平明顯升高，且雷米普利可抑制VMC中心肌細胞的凋亡，提示雷米普利可用于VMC的治療。本研究提示過表達miR-21、沉默CCL20對心肌細胞具有保護作用。

炎癥為機體損傷和抗損傷的統一過程，其中損傷因子(細菌、病毒等異物)可直接或間接造成組織和細胞的損傷，也可通過炎癥充血和滲出反應，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子〔16，17〕。IL-17 是由活化的T 細胞產生的致炎因子，其可激活T 細胞，刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生IL-6、IL-8、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、細胞黏附分子(CAM)-1，從而導致炎癥的產生〔18，19〕。心肌炎患者最顯著的特征為心肌細胞中炎性因子分泌增加，嚴重者可至心肌壞死。Yuan等〔20〕在急性病毒性心肌炎的研究中構建了CVB3誘導的BALB/c小鼠急性病毒性心肌炎(AVMC)模型發現，小鼠脾臟Th17細胞、血清IL-17、心臟IL-17 mRNA表達顯著升高，并伴有AVMC心臟損傷，IL-17可中和分泌抗病毒細胞因子干擾素(IFN)-γ的Th1和CD8+T細胞的表達，上調脾Th1和CD8+T細胞和心臟IFN-γ mRNA水平，使病毒復制減少，心肌炎性細胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β的含量均減少，揭示Th17細胞參與了AVMC中CVB3的復制，IL-17可能是調節抗病毒免疫平衡的重要靶點。本研究發現，過表達miR-21、沉默CCL20均可下調心肌巨噬細胞中IL-17的含量。

綜上，miR-21可降低CCL20表達減輕心肌炎的炎性反應，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能與靶向CCL20有關，為急性心肌炎的治療提供靶點。