MiR-506-3p靶向TRAF6抑制心肌炎的炎性反應和心肌細胞凋亡

陽慧 蘇雨江 鐘江華 馬添翼

(海口市人民醫院心血管內科，海南 海口 570208)

心肌炎臨床癥狀包括心律失常、心源性休克、急性心功能不全等，是一種心肌炎性疾病〔1〕。自身免疫性疾病、感染、物理化學刺激等多種因素均可引起心肌炎，其中腸道病毒引起的病毒性心肌炎(VMC)較為普遍，而柯薩奇B組病毒(CVB)3是引起VMC的常見病毒〔2，3〕。目前，VMC的診斷包括心電圖、血清檢測、心臟磁共振成像、心內膜心肌活檢等，其治療方式在支持治療的基礎上結合了免疫療法和抗病毒治療，為重癥VMC患者帶來了曙光〔4，5〕。但VMC在臨床診斷與治療中仍面臨挑戰，探索VMC發生發展機制及臨床治療靶點具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是非編碼RNA分子，通過干擾內源性RNA而調節多數人類基因功能，參與調控細胞增殖、凋亡、分化、免疫反應等生物過程〔6〕。miRNA在人體多種病灶組織中異常表達，隨疾病程度的加深其表達水平也發生變化，是特定疾病診斷的標志物〔7〕。研究表明〔8，9〕，miRNA分子可調節炎性細胞因子水平，參與病毒誘導的免疫反應。目前，關于miR-506-3p的研究相對較少，miR-506-3p與TRAF6在心肌細胞中是否存在靶向關系尚無報道，本文檢測了miR-506-3p在正常大鼠和VMC模型大鼠心臟組織中的表達及其對心肌細胞炎性因子水平、細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 20只4周齡雄性SD大鼠(合格證號：中科動管007號)購自中國科學院上海實驗動物中心；Eagle′s液(批號：GNM-14266)購自上海經科化學科技有限公司；Ⅱ型膠原酶(批號：S10054)購自上海源葉生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(批號：E1910)購自美國Promega公司；兔抗人腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6多克隆抗體(批號：PAB12896)、兔抗人GAPDH多克隆抗體(批號：PAB1187)購自上海煊翎生物科技有限公司；胎牛血清(批號：10099-141)、DMEM培養基(批號：31053028)、胰蛋白酶(批號：20230)購自賽默飛世爾科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(批號：11668027)購自美國Invitrogen公司；人腫瘤壞死因子(TNF)α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：K4779)、白細胞介素(IL)-6 ELISA檢測試劑盒(批號：583361)、IL-1β ELISA檢測試劑盒(批號：583311)購自武漢艾美捷科技有限公司；TaKaRa反轉錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Hoechst 33342染色劑(批號：C0030)、Trizol試劑(批號：15596)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號：BSP0161)、4% 多聚甲醛(批號：P1110)、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(批號：R0020)購自北京Solarbio公司；MCO-18AC型CO2培養箱購自日本SANYO公司；流式細胞儀購自美國BD公司；NanoDrop微量核酸測定儀購自上海創萌生物科技有限公司；熒光顯微鏡購自上海炳宇光學儀器有限公司。

1.2動物模型制備 將20只SD大鼠隨機分為健康組、模型(VMC)組各10只。參照蔣娜等〔10〕實驗方法，將大鼠培養于無特定病原體環境中，給予普通飼料喂養。模型組大鼠腹腔注射0.1 ml含1×102TCID50 CVB3 Eagle液建立VMC模型，對照組大鼠腹腔僅注射0.1 ml不含病毒的Eagle液，所有大鼠注射頻率均為1次/d，共3 w。注射結束后處死大鼠，迅速摘取心臟并放入液氮，用于細胞分離與總RNA提取。

1.3心肌細胞分離培養與分組 取適量VMC組大鼠心臟組織，無菌條件下切成1 mm3左右的組織塊，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫孵育20 min，離心棄上清；加入0.2%Ⅱ型膠原酶孵育4 h，120目篩過濾，PBS洗滌。含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5% CO2條件下培養心肌細胞，2～3 d更換新鮮培養基。將對數期生長的心肌細胞接種于6孔板，細胞融合度約50 % 時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書分別將模擬物對照、miR-506-3p模擬物、miR-506-3p抑制劑轉染至心肌細胞，依次標記為對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組，常規培養24 h。

1.4RT-qPCR 收集健康組、VMC組大鼠心臟組織和對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細胞，采用Trizol法提取總RNA，NanoDrop微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，使用TaKaRa RT-qPCR試劑盒配制反應體系，以GAPDH為內參進行PCR擴增。miR-506-3p引物：上游：5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′，下游：5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′；TRAF6引物：上游：5′-CCCAATTCCATGCACATTCAGTA-3′，下游：5′-AACAGCCTGGGCCAACATTC-3′；GAPDH引物：上游：5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。每個RNA樣品重復3次，采用2-△△Ct法計算miR-506-3p相對表達量。

1.5心肌TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 收集對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細胞，胰酶消化并重懸，超聲粉碎后離心取上清。分別使用試劑盒檢測。

1.6細胞凋亡檢測 收集對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗滌后加入Hoechst 33342染色劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌，使用熒光顯微鏡觀察并記錄細胞凋亡情況。

1.7雙熒光素酶報告基因實驗 取分離培養的VMC組大鼠心肌細胞，使用Lipofectamine 2000轉染試劑將TRAF6 3′-UTR野生型載體分別與模擬物對照、miR-506-3p抑制劑、模擬物抑制劑、miR-506-3p抑制劑共轉染，繼續培養48 h；加入細胞裂解液裂解細胞，4℃，12 000 r/min離心10 min取上清，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.8Western印跡法 取對照組、miR-506-3p組、anti-miR-506-3p組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結束后將蛋白樣品電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h。分別加入兔抗人TRAF6多克隆抗體(1∶500)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)，分別加入相應的一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗滌，使用電化學發光試劑盒顯示條帶，每個蛋白樣品重復3次。

1.9統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-506-3p在大鼠心肌組織中的表達 VMC組大鼠心臟組織中miR-506-3p相對表達水平(1.00±0.12)顯著低于健康組大鼠心臟組織(0.53±0.05，P<0.05)。

2.2miR-506-3p在心肌細胞中的表達 與對照組(1.00±0.08)相比，miR-506-3p模擬物組細胞中miR-506-3p表達(7.78±0.39)顯著上調(P<0.05)；anti-miR-506-3p組細胞中miR-506-3p表達(0.43±0.06)顯著下調(P<0.05)。

2.3miR-506-3p調節TNF-α、IL-6、IL-1β水平 與對照組比較，miR-506-3p模擬物組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P<0.05)；anti-miR-506-3p組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表1。

2.4miR-506-3p調控心肌細胞凋亡 對比對照組〔(7.43±0.69)%〕，轉染miR-506-3p模擬物的VMC組大鼠心肌細胞凋亡率〔(4.66±0.53)%〕明顯降低(P<0.05)；而轉染miR-506-3p抑制劑的VMC組大鼠心肌細胞凋亡率〔(17.31±1.12)%〕明顯升高(P<0.05)。

2.5TRAF6是miR-506-3p的潛在靶基因 通過Targetscan在線預測發現，TRAF6 3′-UTR上存在miR-506-3p的結合位點(圖1)，猜測TRAF6是miR-506-3p的潛在靶基因。進一步使用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，發現TRAF6 3′-UTR野生型載體與miR-506-3p模擬物共轉染的細胞中熒光素酶活性(0.46±0.05)顯著降低(P<0.05)；而TRAF6 3′-UTR野生型載體與miR-506-3p抑制劑共轉染的細胞中熒光素酶活性(1.41±0.12)顯著增強(P<0.05)。

表1 miR-506-3p調節TNF-α、IL-6、IL-1β水平

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 TRAF6 3′-UTR與miR-506-3p的互補序列

2.6miR-506-3p可負調控心肌炎細胞中TRAF6表達 在VMC組大鼠心肌細胞中，與對照組比較，miR-506-3p模擬物組TRAF6在mRNA和蛋白水平的表達顯著下調(P<0.05)，anti-miR-506-3p組TRAF6在mRNA和蛋白水平的表達顯著上調(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組細胞中TRAF6蛋白凝膠電泳圖

組別TRAF6 mRNATRAF6蛋白對照組1.00±0.070.52±0.04miR-506-3p模擬物組0.56±0.051)0.19±0.031)anti-miR-506-3p組3.48±0.311)0.82±0.071)

3 討 論

VMC是病毒感染引起的心肌彌漫性或局灶性疾病，目前已知其發病機制主要包括免疫反應、氧化作用、遺傳背景、病毒直接作用4個方面〔11〕。CVB與心肌細胞表面特異受體結合，從而感染細胞；宿主識別入侵病毒而產生免疫反應，誘導細胞凋亡并刺激產生TNF-α、IL、轉化生長因子等大量細胞因子，促進細胞炎性反應〔12，13〕。TNF-α在炎性反應中起始動作用，可誘導IL-1、IL-6等細胞因子，加速B細胞和T細胞增殖，提高免疫球蛋白水平，是單核巨噬細胞被活化后分泌的一種炎性細胞因子〔14〕。已有研究表明，TNF-α、IL-6、IL-1β水平的降低能夠緩解炎性反應〔15〕。

miRNA廣泛存在于真核生物中，具有高度保守性，可通過下游靶基因調控多種疾病進展。Rebane等〔16〕研究表明，miR-146a能夠抑制TNF-α、IL-1β等多種炎性因子表達，緩解炎性反應。Jiang等〔17〕研究表明，miR-155在丙型肝炎病毒引起的免疫應答和炎性反應中發揮抑制作用，其機制與轉化生長因子β、IL-10有關。提示，應深入研究miRNA在免疫應答及炎性反應中的作用機制，可能為miRNA在炎性疾病的診斷和治療中提供理論基礎。miR-506定位于X染色體，是近年來新鑒定的一種RNA分子，有報道稱，miR-506在腫瘤發展中發揮抑制作用，miR-506在多種腫瘤組織中表達下調，可調節多個下游靶基因，調控細胞增殖、遷移和侵襲〔18，19〕。其家族成員之一的miR-506-3p已被證實在非小細胞肺癌組織中表達下調，通過抑制細胞遷移、侵襲發揮抑癌功能〔20〕。

TRAF6是TNF受體超家族和IL-1受體信號轉導的關鍵銜接分子，可激活核轉錄因子(NF)-κB等信號通路，調控胚胎發育、骨代謝、炎性反應、氧化應激、免疫應答等生物學過程〔21〕。Zhu等〔22〕研究表明，TRAF6通過調節IL-1β，IL-8，IL-6，TNF-α等炎性因子水平，參與調控類風濕性關節炎炎性反應；Aarts等〔23〕研究表明，抑制TRAF6后，細胞活性氧、IL-6和TNF水平降低，改善了神經炎性反應。

在心肌炎的相關研究〔24，25〕中，TRAF6已被證實與心肌炎性反應有關，抑制TRAF6可減輕心肌炎的嚴重程度。本文驗證了TRAF6和miR-506-3p的靶向關系，在VMC模型大鼠心肌細胞中轉染miR-506-3p模擬物，TRAF6表達下調(P<0.05)；轉染miR-506-3p抑制劑則TRAF6表達上調(P<0.05)。

綜上，miR-506-3p在心肌炎組織中呈低表達，過表達miR-506-3p可減緩心肌細胞炎性反應并抑制細胞凋亡，其機制可能與抑制TRAF6表達從而降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平有關。這一研究結果為心肌炎的診斷與治療提供理論基礎。