生脈飲對蒽環類藥物所致心肌毒性的保護作用

張贏予 張馨木 苗軍

(1長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；2吉林大學藥學院；3吉林大學中日聯誼醫院藥學部)

蒽環類藥物抗腫瘤活性廣譜高效，臨床療效顯著，但其累積劑量導致嚴重的胃腸道反應、脫發、骨髓抑制和心臟毒性等明顯的毒副作用。其中心臟毒性作用最常見最嚴重，明顯降低患者生活質量，長期應用甚至導致致死性心肌損傷，顯著縮短生存期，極大程度地限制其在臨床上的應用〔1〕。尋找相應的治療方案對其有效抗腫瘤的同時降低誘發心臟毒性風險的意義重大。目前主要預防策略為限制其總劑量，降低累積劑量所致心臟毒性損傷；而心臟保護劑的應用使其保證治療效果的同時最大程度保護心肌。研究表明，生脈飲(SMY)可通過多種作用機制保護心血管系統，有效治療心血管疾病〔2〕,能抑制蒽環類藥物多柔比星(DOX)誘導的心肌纖維化、調節心臟免疫微環境、抑制心臟重塑、改善心功能〔3〕。本研究觀察SMY對DOX誘導心肌損傷的影響并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗儀器與材料 心臟彩超儀(型號：Sonos 5500，惠普公司)；熒光酶標儀(型號：K3，賽默飛世爾公司)；透射電鏡(型號：JEM-1230，JEOL電子株式會社)。SMY北京同仁堂科技發展股份有限公司；DOX為Sigma-Aldrich公司；HE染色試劑盒購自晶都生物技術有限公司；蛋白濃度測定試劑盒購自生工公司；BCL-2、Bax抗體購自CST公司；活性氧物質(ROS)熒光測定試劑盒購自杰美醫藥科技；細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.2實驗動物分組 SPF級環境飼養健康雄性Balb/c小鼠(6～8 w，20～25 g)40只，隨機分為四組(n=10)：①對照組(Control組)：生理鹽水腹腔注射同時生理鹽水灌胃；② DOX模型組(DOX組)：DOX 2 mg/kg腹腔注射，生理鹽水灌胃，給藥8 w；③DOX+SMY低劑量組(DOX+低SMY組)：建模并SMY按0.1 ml/kg每日灌胃給藥；④DOX+SMY高劑量組(DOX+高SMY組)：建模同時予SMY 0.2 ml/kg每日灌胃。

1.3心功能檢測 異氟醚麻醉小鼠，15 MHz小動物高頻超聲探頭行心臟彩超。于乳頭肌水平移動探頭確保對齊左室長軸，采集清晰圖像，測量心臟形態，計算左室舒張末期內徑(LVEDD)，左室收縮末內徑(LVESD)和左室射血分數(LVEF)。

1.4病理學檢測 肝素灌洗心臟組織去除血塊，10%中性甲醛過夜固定，剪至厚度2～3 mm，常規石蠟包埋切片(厚度約5 μm)、HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5超微結構觀察 2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，再次漂洗，酒精梯度脫水，包埋、固化、切片；3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色；透射電鏡下觀察超微結構形態。

1.6ROS含量檢測 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗心肌組織并制成組織懸液；稀釋特異性熒光探針2′,7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽，滴加入組織懸液，37℃孵育30 min；期間每3～5 min混勻使探針和心肌組織充分接觸，PBS洗滌除去殘余探針，熒光酶標儀檢測ROS熒光含量(激發波長：488 nm，發射波長：525 nm)。

1.7Western印跡法檢測凋亡蛋白表達 提取心肌總蛋白Bradford法定量后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉印至PVDF膜上，并置于含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液中封閉非特異性結合位點，4℃過夜；TBST洗滌，Bcl-2和Bax一抗 4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h，ECL plus顯色,凝膠成像系統行灰度掃描并分析，計算各蛋白與內參β-actin的比值作為相對灰度值，表示目的蛋白的相對表達水平。

1.8TUNEL法檢測心肌凋亡指數 固定、封閉、通透、TdT反應、辣根過氧化物-鏈霉親和素反應、二氨基聯苯胺法顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化，自來水返藍；酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，顯微鏡下觀察并計數凋亡陽性細胞數(判斷標準：陰性細胞即未發生凋亡的細胞，核染色為藍色；陽性細胞即凋亡細胞，胞核染色呈深棕色或棕黃色顆粒)計算凋亡指數(AI)。AI=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.9統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1SMY改善心功能 ①與Control組相比較，DOX組(死亡1只)和DOX+低SMY組小鼠LVEF顯著下降(P<0.01，P<0.05)，LVEDD和LVESD顯著增大(均P<0.05)；DOX+高SMY組LVEF下降不具有統計學意義(P>0.05)；②與DOX組相比，DOX+低SMY組LVEF升高不顯著(P>0.05)，而DOX+高SMY組LVEF顯著提高，LVEDD和LVESD顯著減小(均P<0.01)；③DOX+高SMY組較DOX+低SMY組LVEF顯著升高，LVEDD和LVESD顯著減小(均P<0.05)。見表1。

表1 SMY改善DOX引起的心功能障礙

與Control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與DOX組比較:3)P<0.01；與DOX+低SMY組比較:4)P<0.05

2.2SMY減輕病理損傷 ①Control組心肌組織結構正常，排列整齊紋理清晰，核染色為藍紫色；②DOX組較大部分心肌組織呈變性壞死，明顯腫脹，核消失；細胞間隙增寬、心肌纖維有較多的局限性斷裂，毛細血管充血擴張，密度顯著增加，膠原及彈性纖維增生；淋巴細胞和炎性細胞浸潤明顯；③DOX+低SMY組心肌組織各部位有不同程度心肌變性、斷裂、壞死及纖維化等病理損傷，較DOX組稍有好轉；④DOX+高SMY組心肌病理改變僅局限在散在的心肌中，未見大范圍變性壞死，改善較DOX+低SMY組更為明顯，見圖1。

2.3SMY改善超微結構改變 ①Control組心肌肌原纖維不明顯，肌漿網稀疏，橫小管和閏盤位于Z線水平，線粒體較為豐富，嵴排列整齊。②DOX組心肌超微結構損傷明顯，橫管與肌質網超微結構均有不同程度的損傷，肌小節減少和結構錯亂，絕大部分線粒體腫脹、出現空泡、嵴斷裂或外膜破裂。③DOX+低SMY組超微結構較DOX組稍有改善，但仍有較多的線粒體結構損傷。④DOX+高SMY組心肌超結構改善更為明顯，線粒體嵴排列整齊，見圖2。

圖1 SMY減輕DOX所致心肌病理損傷(HE，×200)

圖2 SMY改善DOX所致心肌超微結構損傷(×15 000)

2.4SMY減少ROS過度累積 ①與Control組〔(321.25±14.26)熒光密度/mg pro〕相比，DOX組〔(598.72±19.43)熒光密度/mg pro〕小鼠心肌組織內ROS熒光含量顯著升高(P<0.01)；②DOX+低SMY組〔(431.22±15.26)熒光密度/mg pro〕和DOX+高SMY組〔(339.31±12.24)熒光密度/mg pro〕較DOX組〔(598.72±19.43)熒光密度/mg pro〕ROS熒光強度顯著減弱(均P<0.05)。③而DOX+高SMY組〔(339.31±12.24)熒光密度/mg pro〕較DOX+低SMY組〔(431.22±15.26)熒光密度/mg pro〕ROS熒光強度減弱更為顯著(P<0.05)。

2.5SMY降低凋亡相關蛋白的表達 ①促凋亡蛋白Bax表達水平比較，DOX組(0.35±0.03)較Control組(0.17±0.01)顯著升高(P<0.05)，而DOX+低SMY組(0.21±0.03)和DOX+高SMY組(0.19±0.02)與Control組(0.17±0.01)無顯著差別(均P>0.05)；DOX+低SMY組(0.21±0.03)和DOX+高SMY組(0.19±0.02)比DOX組(0.35±0.03)顯著降低(均P<0.05)。②抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平相比較，DOX組(0.29±0.03)較Control組(0.41±0.02)顯著降低(P<0.05)，而DOX+低SMY組(0.39±0.02)和DOX+高SMY組(0.38±0.04)與Control組(0.41±0.02)無顯著差異(均P>0.05)；DOX+低SMY組(0.39±0.02)和DOX+高SMY組(0.38±0.04)均比DOX組(0.29±0.03)顯著增高(均P<0.05)(見圖3)。

1～4：Control組、DOX組、DOX+低SMY組、DOX+高SMY組圖3 SMY降低凋亡相關蛋白的表達

2.6SMY延緩心肌凋亡 ①DOX組〔(66.59±3.27)%〕和DOX+低SMY組〔(61.35±4.02)%〕較Control組〔(23.37±2.56)%〕AI顯著增高(均P<0.01)；DOX+高SMY組〔(26.11±2.79)%〕與Control組〔(23.37±2.56)%〕無顯著差異(P>0.05)。②DOX+低SMY組〔(61.35±4.02)%〕與 DOX組〔(66.59±3.27)%〕，AI無顯著差異(P>0.05)；DOX+高SMY組較DOX組和DOX+低SMY組AI均顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 SMY緩解DOX誘導的心肌凋亡(DAB，×200)

3 討 論

蒽環類化療藥物在多重細胞分子機制的影響下產生心肌毒性損傷〔4〕，研究較多的學說為：①超氧自由基損傷學說：其在體內代謝產生的超氧自由基導致心肌細胞發生氧化應激損傷；②鈣離子超載及能量代謝障礙學說；③細胞凋亡學說：通過線粒體途徑、Fas/Fas L途徑、絲裂原活化蛋白激酶途徑、P53 途徑、轉錄因子GATA-4途徑、神經酰胺信號通路，導致心肌過度凋亡；④自噬學說〔5〕。SMY治療多種心臟疾病療效確切，能有效緩解患者呼吸困難、乏力、下肢水腫等典型癥狀，減緩心室重塑，改善心功能，提高左室舒張能力〔6〕。體內外實驗研究顯示，SMY通過抗氧化、抑制心肌纖維化、抗凋亡、改善心肌缺血〔7,8〕等機制對心肌損傷起保護作用。

現代藥理研究結果表明，SMY主要有效成分為人參、麥冬、五味子。人參中主要成分人參皂苷Rb1和Rg3通過抗氧化、減少鈣超載、穩定線粒體膜電位、抑制細胞凋亡和自噬，拮抗DOX導致的心肌損傷，保護心血管系統〔9,10〕。麥冬主要成分麥冬皂苷D通過減輕內質網應激及緩解DOX誘導的自噬保護心肌〔11,12〕。五味子主要成分五味子乙素能通過MAPK/P53信號通路，抑制DNA損傷，通過抗炎抗氧化抑制DOX誘導的心肌功能障礙〔13〕。本實驗研究結果說明，SMY能明顯緩解蒽環類藥物引起的亞細胞器病理損傷，改善心肌結構；緩解心肌收縮力下降和心功能障礙。同時，明顯降低ROS過度累積，顯著緩解過氧化損傷。并且，降低促凋亡蛋白表達水平，增加抗凋亡蛋白的表達，減緩心肌過度凋亡，改善心功能。