老年原發性肝癌患者血清miRNA-200c水平及其與臨床病理特征和預后的關系

殷焦 陳慶 李正平 楊林

(1湖北文理學院醫學院分子醫學中心，湖北 襄陽 441053；2中國人民解放軍聯勤保障部隊第991醫院)

原發性肝癌為世界6大惡性腫瘤之一，在各個年齡段均可發病，死亡率比較高；我國原發性肝癌也比較常見，其發病率和死亡率比較高〔1〕。原發性肝癌早期癥狀不明顯，容易被忽視，多數原發性肝癌患者被發現時已經處于中晚期；原發性肝癌如果沒有進行及時治療，平均生存時間只有3個月左右〔2〕。近年來隨著醫療水平的發展，使許多早期原發性肝癌患者被發現并進行了有效治療，但因原發性肝癌容易復發和轉移，因此預后仍不太樂觀〔3〕。微小RNA(miRNA)調節翻譯后基因表達，從而調控惡性腫瘤細胞的增殖分化和凋亡等過程〔4〕。miRNA的差異表達在多種惡性腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用〔5〕，miRNA-200c在多種惡性腫瘤中表達異?！?，7〕。本文對老年原發性肝癌患者血清miRNA-200c水平進行研究，探討其在老年原發性肝癌的發生發展、診斷、預后預測中的價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇90例老年原發性肝癌患者作為肝癌組，90例同期體檢的健康老年人作為對照組。肝癌組年齡(75.43±4.16)歲；男58例，女32例；乙型肝炎病毒(HBV)陽性74例，陰性16例；有肝硬化77例，無肝硬化13例；腫瘤直徑(3.67±1.02)cm；低分化25例，中分化29例，高分化36例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期22例，Ⅲ期33例，Ⅳ 期8例；有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移54例。對照組年齡(74.58±4.32)歲，男53例，女37例。對照組和肝癌組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經倫理委員會審批。納入標準：肝癌組患者經病理證實為原發性肝癌，首次手術治療，手術前未進行放化療等其他治療；對照組無肝病病史。排除標準：其他惡性腫瘤者，嚴重重要臟器功能障礙者，依從性差未正規隨訪者，失訪者，資料不全者。

1.2血清miRNA-200c水平測定 肝癌組于術前抽取靜脈血4 ml、對照組于體檢當天抽取靜脈血4 ml，根據RNA提取說明書提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度，將提取的RNA反轉錄為cDNA，采用實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定血清miRNA-200c水平，以U6為內參，PCR條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s、56℃ 60 s，共42個循環。以2-ΔΔCt表示血清miRNA-200c水平。

1.3隨訪 采用門診隨訪和電話隨訪，隨訪開始時間為手術時間，隨訪結束時間為死亡時間或隨訪截止時間，隨訪截止時間為2016年12月31日。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，血清miRNA-200c水平對原發性肝癌的診斷價值采用受試者工作特征(ROC)曲線分析，血清miRNA-200c水平與預后的關系采用Kaplan-Meier法，取P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組血清miRNA-200c水平比較 肝癌組血清miRNA-200c水平明顯低于對照組(0.57±0.08 vs 1.00±0.05,t=43.241,P=0.000)。

2.2血清miRNA-200c水平與原發性肝癌臨床病理特征的關系 血清miRNA-200c水平與原發性肝癌的分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(均P<0.05)，其中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ 期、有淋巴結轉移者血清miRNA-200c水平明顯低于中-高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移者；血清miRNA-200c水平與原發性肝癌患者的年齡、性別、HBV感染、肝硬化、腫瘤直徑無關(P>0.05)，見表1。

表1 血清miRNA-200c水平與原發性肝癌臨床病理特征的關系

2.3血清miRNA-200c水平對原發性肝癌的診斷價值 血清miRNA-200c水平診斷原發性肝癌的ROC曲線下面積為(AUC)為0.811，95%CI為0.808～0.814，診斷臨界值為0.51，靈敏度為91.02%，特異度為69.53%。見圖1。

2.4血清miRNA-200c水平與原發性肝癌患者生存期的關系 血清miRNA-200c水平以ROC曲線診斷臨界值0.51為界，分為高表達組和低表達組，高表達組總生存率和無病生存率均明顯高于低表達組(P<0.05)。見圖2和圖3。

圖1 血清miRNA-200c水平診斷原發性肝癌的ROC曲線

圖2 血清miRNA-200c與原發性肝癌總生存率的Kaplan-Meier曲線

圖3 血清miRNA-200c與原發性肝癌無病生存率的Kaplan-Meier曲線

3 討 論

原發性肺癌因缺乏敏感有效的診斷方法，致死率比較高〔8〕，因此尋找敏感有效的診斷方法具有重要意義。甲胎蛋白為比較常用的篩查原發性肝癌的腫瘤標志物，但仍存在許多缺陷，有大概1/3的早期原發性肝癌患者不能用甲胎蛋白檢出，甲胎蛋白篩查原發性肝癌的靈敏性也不高。近年來，miRNA作為單鏈、小分子、非編碼、內源性分子在惡性腫瘤的研究中廣泛應用。miRNA為高度保守、內源性的一組小分子非編碼RNA，長21～25個核苷酸，通過與mRNA的3′-UTR區域結合發揮對翻譯過程的調節作用，從而參與細胞分化、增殖、凋亡等多種過程；從體液、器官、組織中提取的miRNA對溫度、pH值、RNA酶活性均具有一定耐受性，該特性使其具有潛力成為多種疾病的生物標志物。miRNA與多種惡性腫瘤關系密切，多種惡性腫瘤組織中miRNA表達與正常組織存在差異；miRNA的異常表達參與惡性腫瘤的發生、發展過程，可能成為區分惡性腫瘤組織和正常組織的標志物〔9〕。miRNA在不同惡性腫瘤組織和正常組織中的表達具有組織特異性，使其成為惡性腫瘤臨床診斷的潛在標志物〔10〕。多種miRNA在原發性肝癌中的表達也存在異常，在原發性肝癌的發生發展中發揮重要作用，為原發性肝癌診斷和預后評價的潛在生物標志物〔11〕；miRNA在健康人群和原發性肝癌患者血清中的表達也存在差異，因此血清miRNA水平也成為原發性肝癌診斷、術后復發、生存率預測的潛在標志物〔12，13〕。miRNA-200家族包括多個家族成員，miRNA-200c為miRNA-200家族成員之一，定位于人12號染色體上，在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用〔14～16〕，如miRNA-200c在Ⅲc期卵巢漿液性囊腺癌組織中表達升高，與卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力關系密切，臨床上檢測miRNA-200c對上皮性卵巢癌的進展及轉移具有重要價值，過表達miRNA-200c有望成為治療卵巢癌的手段之一〔17〕；miRNA-200c參與胰腺癌的上皮-間充質轉化，影響人胰腺癌細胞的侵襲和遷移能力〔18〕；miR-200c通過P53/P21信號轉導通路誘導非小細胞肺癌細胞凋亡，逆轉非小細胞肺癌細胞對甲氨蝶呤的耐藥性〔19〕。來源于惡性腫瘤組織的miRNA可在血液中穩定存在，因此血清miRNA水平可反映其在惡性腫瘤組織中的表達，因惡性腫瘤組織受取材限制，而血清miRNA水平檢測更為方便，因此研究血清miRNA水平的意義受到大家的青睞〔20〕。程佩宇等〔21〕研究發現結直腸癌患者血清 miRNA-200c水平降低，血清miRNA-200c水平與結直腸癌的分化程度、臨床分期和淋巴結轉移關系密切，血清miRNA-200c檢測有望成為結直腸癌的診斷和預后判斷的潛在生物標志物。本研究結果表明血清miRNA-200c在老年原發性肝癌的病情評估、診斷、判斷預后中具有潛在價值，有望成為老年原發性肝癌的潛在生物標志物。