一種適用于高通量基因分型的水稻DNA樣本制備技術研究

夏澳運，彭子艾，李丹丹，趙壯壯，王 慧，陳志強，郭 濤

（華南農業大學國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其產量占世界糧食總產量的50 %左右，世界上一半以上人口以稻米為主食［1-2］。水稻新品種的選育對于提升糧食安全水平具有重要意義，而種質資源的不斷創新是水稻新品種選育的基礎。近年來，分子標記輔助選擇技術已經在水稻抗病及品質種質創新方面開展了大量研究，顯著提升了水稻新品種選育的效率［3］。此外，誘變育種技術在豐富種質資源、加速育種進程方面也起到了重要作用［4］。將分子育種、誘變育種與傳統育種技術結合，可以不斷豐富水稻遺傳資源，提升水稻新品種選育效率。對于分子育種或誘變育種獲得的遺傳分離群體，利用分子標記獲取不同個體的基因型來說，是種質資源精確鑒定的強有力手段［5］。

【前人研究進展】對于植物基因分型來說，一般都需要從數量龐大的遺傳分離群體中進行篩選，同時要實現單株與DNA樣本一一對應，以便準確篩選出目標植株，而對某基因的定位也經常需要從成千上百份分離群體中提取DNA來篩選目標位點，其工作量之大顯而易見［6］。目前，普遍采用的方法是剪取植物的葉片并提取DNA，但面對大批量樣本采集時，該方法成本高、效率低且容易出現單株與DNA樣本無法對應的錯誤［7］。此外，目前普遍使用的DNA 提取方法為 SDS法或CTAB法，雖然這些方法提取的 DNA 質量、產量和純度均較高，但操作步驟多、耗時長、成本高，成為限制水稻大規模基因分型中提高效率和降低成本的關鍵因素［8-11］。

【本研究切入點】在大規模基于PCR的基因分型檢測作業中，高效、快速、簡便的模板DNA制備顯得非常重要，針對目前組織樣本獲取和DNA提取效率低的問題，建立一種適用于高通量基因分型的簡易、高效和低成本的水稻 DNA 提取方法十分迫切和必要。【擬解決的關鍵問題】為解決限制水稻DNA高效提取問題，探索快速有效的DNA提取方法，本研究從組織取樣與DNA提取兩個方面著手，設計了一次性可采集96個水稻植株的根部組織并快速提取DNA的方法，該方法克服了傳統方法的工作量大、效率低的缺點，在水稻育種實踐中具有較大價值，為水稻分子育種提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

器材：水稻種子，96孔深孔板，96孔PCR板，金屬球（d≈0.27 cm），金屬盤（32 cm×22 cm× 3 cm），24微孔板金屬熱塊（QBLock-0.2），高通量組織研磨機（2010 Genogrinder），玻璃棒（d≈0.35 cm）等。

試劑：干冰，乙醇 （95% V/V），2% CTAB提 取 液，500 mmol/L TRIS（pH=8），50 mmol/L EDTA（pH=9）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理及培養 將水稻種子消毒、浸種、催芽后，挑選胚芽長2.5 mm左右的種子備用（圖1A）。在96深孔板每個孔底部鉆出小孔（圖1B），孔徑約3 mm（圖1C）。將萌發的水稻種子放入96深孔板中，胚向下，每孔1粒種子（圖1D）。深孔板與PCR板上下疊放（圖1E），深孔板在上、PCR板在下，兩者的孔一一對應，即深孔板A1應對應PCR板A1孔，用橡皮筋將兩端固定（圖1F）。固定好的裝置稱為雙層生長板，將生長板放入金屬托盤中，加入蒸餾水漫過下部PCR板（圖1G），水深約3 cm（圖1H），使PCR板的每個孔中均充滿蒸餾水。金屬托盤及生長板（圖1I）放置于培養箱中培養約9 d，培養條件：12 h光照、12 h黑暗，30 ℃恒溫。培養過程中，注意觀察液面高度，及時更換補充蒸餾水至3 cm深。

1.2.2 DNA提取及擴增 （1）CTAB法提取根部DNA，參考 CHEN等［12］的方法進行。（2）磁珠法提取樣本DNA，對獲取的根部組織進行研磨和不研磨兩種處理，參考CHEN等［12］的方法分別提取樣本DNA。（3）改良TRIS-EDTA法提取根部DNA。將 25 μ L TRIS-EDTA（500 mmol/L TRIS，pH=8；50 mmol/L EDTA，pH=9）溶液和根部組織放入含有250 μ L蒸餾水的PCR板孔中密封，組織研磨機粉碎后，3 600 r/min離心10 min，取上清液進行檢測并進行PCR擴增。

圖1 水稻種子的處理與幼苗培養Fig.1 Treatment of rice seed treatment and seedling cultivation culture

引物設計及PCR擴增方法：根據已報道的GS3基因第三外顯子（45 bp）序列設計引物［13］，引物序列由金唯智公司合成，正向序列：5′-GAACTTCGTCGATTGTGTGG-3′，反向序列：5′-GCTTCTCCGATGAACTGCTT-3′，擴增產物大小為250 bp。PCR擴增體系為 10 μL：DNA 模板 1 μL；Master Mix 5 μL；引物各 0.2 μL；ddH2O 3.6 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；然后按 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。取7 μL PCR產物，加入5 μL指示劑，在1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，用凝膠成像儀掃描拍照。

2 結果與分析

2.1 水稻幼苗根部組織捕獲效率分析

水稻種子培養約9 d后，下部PCR板的孔中存在大量的根，可以進行根部組織的捕獲。具體方法如下：（1）從金屬托盤中取出雙層生長板（圖2A），此時水稻幼苗已發育完全（圖2B）。將橡皮筋留在原位，在兩板之間打開一個間隙，小心地在上下板之間插入玻璃棒，在兩個板之間形成一個間隙（圖2C），從孔中可以清晰的觀察到內部的根與苗（圖2D）。（2）將4塊24孔金屬熱塊拼在一起放入金屬盤中。小心地將95% （V/V）乙醇與干冰（乙醇500 mL，干冰3 kg）倒入玻璃盤中，直到混合液體的液面恰好低于金屬熱塊的表面。金屬熱塊冷卻約30 min，使溫度達到平衡（圖2E）。（3）將雙層生長板放置于金屬熱塊上，下部PCR板插入金屬熱塊對應孔中。雙層生長板放在金屬熱塊上約6 min，在此期間下部PCR板中的水將冷凍為冰（圖2F）。6 min后將雙層生長板從金屬熱塊上移出，移除橡皮筋，并從板之間移除玻璃棒。向下按壓上部深孔板，然后小心地分開上部深孔板與下部PCR板，清除下部PCR板表面的殘冰（圖2G）。此時，下部PCR板的孔中即保留了冷凍后的根部組織（圖2H）。收獲根部組織后，上部幼苗可轉移到裝滿水或營養液的金屬托盤中，以使幼苗繼續生長 （圖2I）。利用此方法，成功獲得96個樣本的根部組織，樣本捕獲的成功率為100%；此外，此方法獲得的根部組織長度介于2～3 cm，重量約0.03～0.06 g，各樣品組織均勻一致，為DNA提取奠定了良好基礎。與傳統剪取葉片法比較，本方法獲取96個樣本組織僅耗時約10 min，而剪取葉片法耗時約30 min。

2.2 DNA提取結果分析

圖2 水稻幼根捕獲與DNA提取Fig.2 Rice root capture and DNA extraction

對獲得的根部樣本，采用4種方法進行DNA提取，并比較DNA提取效率。結果（表1）表明，4種方法均可提取水稻幼苗根部DNA，所獲取的DNA可滿足分子標記分析需求。從濃度與質量上來看，相比較其他3種方法，使用改良TRISEDTA法提取的 DNA個體間差異較小，整體濃度較高，濃度平均值為92.54 ng/vL，A260/280平均值為1.74，DNA純度較高；基于磁珠的兩種DNA提取方法，所獲得的DNA濃度差別較大，其中根組織研磨后DNA提取濃度為55.68 ng/μL，顯著高于不研磨的磁珠法。從效率上來看，改良TRIS-EDTA法批量提取DNA的時間明顯低于其他3種方法，效率最高。此外，TRIS-EDTA法提取DNA的費用約為0.1元/樣品，而CTAB法為0.8元/樣品、磁珠法平均為0.5元/樣品。可見，TRIS-EDTA法提取DNA的產量高、效率高、費用低，是比較理想的水稻根部DNA提取技術。

為了比較4種方法提取DNA的PCR擴增效果，利用GS3基因引物分別擴增4種方法獲得的模板DNA。電泳檢測結果（圖3A）表明，4種方法所提取的DNA擴增產物均條帶明亮、清晰，片段大小符合預期，說明4種方法所提取DNA均可用于分子標記分析。改良TRIS-EDTA法提取的基因組DNA在96個樣本中均可擴增出清晰、明亮的目的條帶，具有較高的穩定性（圖3B）。

表1 不同提取方法的DNA濃度、質量及提取時間Table 1 DNA concentration, quality and extraction time of different extraction methods

圖3 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR product

3 討論

隨著越來越多的分子標記可供植物育種者使用，迫切需要能對大量單株進行基因分型的高效方法［14-15］。而大量樣本的種植管理、樣本組織的高效獲取及DNA的有效提取是高通量基因分型的關鍵環節［16-17］。

對于樣本組織的獲取，目前普遍采用的方法是技術人員在田間收取植物的葉片或其他組織器官并編號，但該方法過程煩瑣，成本較高，較易出錯，不適于大規模的樣本收集［18-19］。針對傳統方法缺點，本研究將水稻種植于96孔板中，實現根部組織的批量獲取，同時繼續保留樣本活體，可以在獲取基因型后把目標單株種植到田間。與前人方法相比，本研究的組織獲取方法可顯著降低田間勞作強度，且樣品和DNA可以實現精確對應，具有高效便捷、省時省力的優點。限制高通量基因分型的另一個因素是DNA的快速提取，經典的CTAB或SDS可獲取高質量的DNA，但提取過程煩瑣，成本較高，不適于大規模的基因型檢測［10,20］。目前也報道了各類簡化DNA提取方法，但是這些方法仍然存在提取效率不高的問題［21-24］，如趙國珍等［25］的方法提取96個樣本DNA需耗時1 h。而本研究改良TRIS-EDTA法批量提取96個樣本DNA的時間約為0.3 h，并且DNA質量完全滿足分子標記需求。此外，改良TRIS-EDTA法提取DNA的費用約為0.1元/樣品，而CTAB法為0.8元/樣品。可見，本研究開發的TRIS-EDTA法提取DNA的產量高、效率高、費用低，是比較理想的水稻根部DNA提取技術，非常適合水稻的高通量基因分型。

4 結論

本研究開發的水稻根部組織DNA獲取方法（TRIS-EDTA法）克服了傳統水稻DNA樣本獲取工作量大、費時費力的缺點，可有效服務于水稻分子育種和突變體基因型篩選。此外，該方法還可用于收集水稻根部組織進行代謝組、轉錄組或蛋白質組的高通量分析，對于其他作物的DNA高通量提取也具有參考價值。