電針對慢性應激抑郁模型大鼠海馬突觸可塑性蛋白的影響

葉必宏，劉海飛，李靈浙，潘勝蓮，宋豐軍，王慶來，朱文宗

（浙江中醫藥大學附屬溫州市中醫院 針推理療科，浙江 溫州 325000）

抑郁癥是以情緒低落、快感缺失、行為遲緩等為主要特征的精神類疾病，重度抑郁癥患者會有明顯的自殺念頭及行為[1]。抑郁癥發病機制及其防治研究是現代醫學研究的熱點，目前較為公認的抑郁癥發病機制主要集中在單胺神經遞質、神經營養、細胞因子等，而突觸可塑性變化在其中的關鍵作用也日益受到重視[2]。研究表明，抑郁癥模型大鼠腦內多個位置伴隨著顯著的突觸可塑性下降，表現為結構的缺失以及功能的失常，其中以海馬區研究最為廣泛[3]。電針是傳統中醫療法之一，治療抑郁癥等情緒疾病有其獨特優勢，能夠減輕藥物的不良反應，改善患者軀體化癥候群，穩定患者情緒[4]。然而，盡管電針治療抑郁癥在臨床已廣泛使用，近年來基礎研究也快速發展，但更多集中于對動物行為學及生化指標的探討，機制尚未深入。本研究采用經典的CUMS抑郁模型，通過觀察電針對大鼠海馬區突觸結構及可塑性蛋白表達的影響，深入探討其抗抑郁機制，為其臨床應用提供更多的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠48只，體質量為200～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（滬）2017-0005。整個實驗期間大鼠均飼養在SPF級標準環境中，適應性喂養5 d后開始正式實驗。

1.2 試劑與主要儀器 氟西汀（美國禮來公司）；RIPA裂解液（美國Thermo公司）；兔抗大鼠SYN、PSD-95、CREB、BDNF多克隆抗體（英國Abcam公司）；蘇木素、伊紅（北京中杉金橋生物技術有限公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司）；華佗牌一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）；LH202型電針儀（北京華衛醫藥有限責任公司）；光學顯微鏡（德國ZEISS公司）；核酸蛋白測定儀（英國BioDrop公司）；酶標儀、組織切片機（美國Thermo公司）；凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模 動物隨機分為4 組，包括對照組、模型組、電針組、氟西汀組，每組12只。采用慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法建立抑郁大鼠模型，應激方法包括夾尾（1 min）、冰浴（4 ℃，4 min）、熱水浴（50 ℃，4 min）、傾籠（24 h）、電擊（50 V，3 min）、晝夜顛倒（24 h）、禁水禁食（24 h），每天隨機采取其中一種應激，同一種應激不連續出現，共持續21 d。

1.4 治療與給藥 電針組于每日應激造模前接受電針治療，穴位參照林文注主編的《實驗針灸學》分別選取百會、印堂穴進行針刺，平刺進針，深度約為6 mm，然后接電針儀，強度為1 mA，頻率為2 Hz，每次電針20 min，每日1次，連續21 d。氟西汀組則于每日應激前灌胃給予抗抑郁西藥氟西汀，給藥劑量為10 mg/kg，灌胃體積為10 mL/kg，給藥21 d。對照組和模型組大鼠不予治療或給藥。

1.5 行為學測試

1.5.1 曠場測試：將大鼠放入黑色敞箱中央，待其在敞箱中自由活動1 min后，記錄接下來4 min內大鼠的水平活動次數和垂直站立次數，以兩者之和作為大鼠的曠場評分。

1.5.2 強迫游泳實驗：將大鼠放入高50 cm透明圓柱形水缸中，水深約40 cm，水溫保持在（25±2）℃。待大鼠適應1 min后，記錄接下來4 min內大鼠的不動時間（兩前爪靜止且身體漂浮記為不動）。于應激后7、14、21 d分別進行曠場測試和強迫游泳實驗。

1.6 Golgi染色 行為學測試完成后，麻醉大鼠，剝離海馬，部分固定于4%多聚甲醛中用于病理組織觀察，另一部分速凍于液氮中用于分子生物學指標檢測。取固定于4%多聚甲醛溶液中的海馬組織，用梯度濃度乙醇脫水后，將組織切成小塊，置于硝酸銀水溶液中完全浸泡鍍銀，在充分鍍銀后，以50 μm連續切片，漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后置于光學顯微鏡下觀察神經元突觸形態。

1.7 Western blot實驗 取冷凍保存的海馬組織，加入5倍體積的RIPA裂解液，冰上勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，待膠凝固后上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳完成后，轉移蛋白至PVDF膜上，室溫下封閉1 h，根據目的蛋白分子量裁剪條帶，加入稀釋后的一抗（SYN：1:1 000，PSD-95：1:1 000，CREB：1:1 000，BDNF：1:1 000，GAPDH：1:500），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌4次，每次10 min，加入二抗（按1:2 000稀釋），室溫下孵育4 h，洗滌，ECL顯影。應用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/GAPDH灰度值計算蛋白相對表達水平。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行數據分析，計量數據用表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠曠場測試結果 與對照組比，模型組大鼠從應激第14 天開始自主活動評分顯著下降（P＜0.05），至造模結束后下降更為明顯（P＜0.01）；經電針治療后，大鼠自主活動評分和氟西汀組一樣較模型組顯著上升（P＜0.05），與氟西汀組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠強迫游泳實驗結果 與對照組比，模型組大鼠于應激第7天起不動時間即顯著增加（P＜0.05）；經電針治療14 d后，大鼠不動時間明顯下降（P＜0.05），在治療21 d后，不動時間下降更為明顯（P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬Golgi染色結果 正常大鼠海馬神經元豐富，樹突棘分枝較長，分布均一，排列整齊致密；模型組大鼠海馬神經元排列散亂，樹突棘萎縮，分枝變短，稀疏無規則，突觸損傷明顯；經電針和氟西汀治療后，模型大鼠神經元突觸損傷情況得以緩解，表現為神經元數量增加，樹突密度及長短逐漸恢復，排列整體有序。見圖1。

表1 各組大鼠曠場自主活動評分比較（每組n=12，±s）

表1 各組大鼠曠場自主活動評分比較（每組n=12，±s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01；與模型組比：cP ＜0.05，dP ＜0.01

表2 各組大鼠強迫游泳不動時間比較（每組n=12，±s，s）

表2 各組大鼠強迫游泳不動時間比較（每組n=12，±s，s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01；與模型組比：cP ＜0.05，dP ＜0.01

圖1 各組大鼠海馬神經元突觸結構變化（×200）

2.4 各組大鼠海馬突觸可塑性蛋白表達情況 與對照組比，模型組大鼠海馬突觸可塑性相關蛋白SYN、PSD-95、CREB、BDNF表達均明顯下調（P＜0.01）；經電針治療或氟西汀干預后，上述突觸可塑性蛋白的低表達情況均得到明顯逆轉（P＜0.01）。見圖2和表3。

3 討論

應激與抑郁癥的發生密切相關，慢性、長期、強度不一的應激源是導致抑郁產生并加速其發展的重要原因[5]。CUMS很好地擬合了人類抑郁癥的致病源，是國內外通用的抑郁動物模型。臨床抑郁患者常伴有快感缺失、不愛運動、精神萎靡、悲觀絕望等特征，依據此類特征已形成一系列公認的抑郁動物模型的行為評估方法。在本研究中，21 d慢性應激后，大鼠曠場自主活動評分顯著下降，同時強迫游泳不動時間顯著增加，表現出明顯的不愛活動、行為絕望等抑郁樣行為。經電針或氟西汀治療后，大鼠的抑郁行為明顯減緩，體現了電針良好的抗抑郁療效。

圖2 各組大鼠海馬突觸可塑性蛋白電泳結果圖

表3 各組大鼠突觸可塑性蛋白相對表達量（每組n=6，±s）

表3 各組大鼠突觸可塑性蛋白相對表達量（每組n=6，±s）

與對照組比：aP ＜0.01；與模型組比：bP ＜0.01

突觸是神經元間信息傳遞的基礎，神經元通過突觸互相聯系，從而形成一個復雜的大腦信息處理網絡[6]。研究發現，抑郁癥等神經精神類疾病均伴隨著明顯的突觸病理改變，包括結構改變和功能改變[7]。突觸結構改變通常為神經元突觸的形態、密度異常，具體表現出樹突棘變短變細，數量稀疏，排列散亂。突觸功能改變以突觸可塑性下降為主要特征，包括調控可塑性的相關蛋白的含量變化。SYN和PSD-95分別位于突觸前、后膜，SYN是一種突觸素，其相對表達量一定程度上能決定突觸的數量和密度；PSD-95是突觸后致密區核心構架蛋白之一，參與神經元生長、突起形成和突觸可塑性調節等[8-9]。SYN和PSD-95的表達水平對于中樞神經系統內神經元間的正常信號傳遞起著關鍵調節作用[10]。CREB是一種反應元件結合蛋白，其mRNA表達水平能決定突觸可塑性的功能強弱，在學習記憶中起著“開關”作用[11]。CREB能調控BDNF表達，給予突觸形成過程中所必需的神經營養，促進神經元存活、增殖及損傷后修復再生等[12-13]。

本研究發現，模型組大鼠海馬神經元排列散亂，樹突棘萎縮，分枝變短，稀疏無規則，突觸結構損傷明顯，同時突觸可塑性相關蛋白SYN、PSD-95、CREB、BDNF表達量均顯著降低，突觸可塑性功能障礙；經21 d電針治療后，突觸可塑性蛋白表達上調，突觸損傷得以改善，這可能是電針治療抑郁癥的關鍵作用機制。