姜黃素類似物L6H3對帕金森病大鼠腦部紋狀體中單胺類神經遞質代謝物的影響

鄒瑜馳，陳珺，黃文婷，劉歡，胡健，劉斐，王冬雪，朱麗云，林麗

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 老年醫學科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 藥學院，浙江溫州 325035）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經系統退行性疾病[1]。PD的病理改變是腦部黑質致密部紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經元發生進行性變性，造成黑質紋狀體內DA及相似酶系統的單胺類神經遞質去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）明顯減少。研究報道姜黃素具有神經保護作用[2]，姜黃素類似物L6H3[（E）-3-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）丙-2-烯-1-酮]去除了姜黃素結構中的不穩定的β-二酮基團，具有更好穩定性的同時也能發揮與姜黃素相似的神經保護作用[3]，而L6H3對PD及其腦內神經遞質的影響鮮見報道。本研究探討姜黃素類似物L6H3對PD大鼠腦部紋狀體細胞外液中7種單胺類神經遞質及其代謝物的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：35只SPF級雄性SD大鼠（6～8周齡），體質量250～300 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2015-001。

1.1.2 儀器：腦立體定位儀購于德國KOPF公司；微透析系統包括CMA402型微透析泵、CMA/12型微透析探針（透析膜長度2.0 mm，直徑0.5 mm）、探針引導管、CMA120型清醒動物活動裝置均購于瑞典CMA/Microdialysis公司。Agilent1100型高效液相色譜儀和Aglient C18色譜柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）均購于美國Aglient公司；Decade II SDC電化學分析儀購于荷蘭Antec Leyden公司；低溫離心機購于美國Thermo Fisher公司；XEVO TQ-S micro質譜儀購于美國Waters公司。

1.1.3 試劑：6-羥基多巴胺（6-OHDA）、腎上腺素（epinephrine，E）、NE、DA、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-Dihydroxyphenylaceticacid，DOPAC）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）、5-HT均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，使用耳桿將其頭部水平固定于立體定位儀上，頭部剃毛消毒，在頭部做縱向切口，暴露前囟和人字點。參考《大鼠腦立體定位圖譜》，選取右側紋狀體作為注射區，定位坐標為前囟0.7 mm、中線右旁3.0 mm、硬膜下5.5 mm，并使用臺式牙科鉆在顱骨上鉆出注射口。微量注射器吸取1.5 μg/μL的6-OHDA溶液10 μL（由含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液配制），并使用微量注射泵以10 nL/s的速度進行緩慢注射，且為了使藥物充分彌散，每注射5 μL間隔留針5 min，注射完畢后也留針10 min，最后緩慢勻速退出注射器，縫合處理傷口，待其清醒后回籠正常飼養。

1.2.2 分組：手術后1周，對造模大鼠進行行為學檢測，連續4周，每周1次，每次腹腔注射阿撲嗎啡溶液（0.5 mg/kg）誘發大鼠旋轉行為。取動物置于干凈的盆地，觀察大鼠行為，并記錄每分鐘大鼠向未損傷一側旋轉的次數以及0.5 h內旋轉的總次數。旋轉360°記為1圈/轉（r），普遍認為30 min內旋轉圈數穩定≥7 r/min時，判定該帕金森大鼠模型建立成功[4]。將造模成功的大鼠隨機分為PD組，PD+L6H3組，每組10只。PD+L6H3組連續2周給予L6H3（腹腔注射，50 mg/kg）。另作15只假手術組大鼠，按上述同樣坐標和操作方法，注射等體積含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液。定期觀察記錄大鼠狀態，并按時補充飼料和水分。

1.2.3 色譜條件：色譜柱Aglient C18柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）；流動相為pH=3.0的0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4緩沖液與甲醇的混合液（90:10，V/V；緩沖液中含2.0 mmol/L KCl、0.1 mmol/L Na2EDTA和0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉），流速為0.3 mL/min，柱溫恒定37 ℃。電化學檢測為三電極系統：以玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，并以不銹鋼基體為輔助電極。工作電位為0.55 V，進樣量為20 μL。

1.2.4 微透析活體取樣：在造模后的第4周后開始給藥，L6H3給藥后第1、2周（即造模后第5、6周）和停藥后第1周（即造模后第7周），用給藥時已埋入的引導管分別對假手術組、PD組和PD+L6H3組（每組10只）進行腦部紋狀體組織活體微透析取得細胞外液。取樣時在大鼠輕度麻醉后將探針緩慢地插入引導管定位的紋狀體區，而在大鼠清醒自由活動狀態下，使用Ringer試劑為灌流液，以1.0 L/min的微透析速率收集樣品。為了避免之前外科手術帶來的損傷，前60 min的樣品將會被棄去，收集的樣品被置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.5 LC-MS/MS檢測鼠大腦皮質中L6H3的含量：L6H3給藥24 h后，取鼠大腦皮質，稱重后置于1.5 mL的EP管中，按比例加入裂解液后勻漿，離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取100 μL上清液轉移至新EP管中，加入200 μL乙腈，渦旋1 min，再離心10 min（13 000 r/min，4 ℃），取上清液至內襯管中，放入進樣瓶中進行LC-MS/MS檢測。

2 結果

2.1 大鼠腦內L6H3含量的檢測 給藥后在鼠大腦皮層中能夠檢測到L6H3的存在，表明L6H3能透過大鼠的血腦屏障，見圖1。

圖1 L6H3的結構示意圖及LC-MS/MS檢測L6H3的色譜圖

2.2 PD組大鼠腦部損傷側紋狀體中單胺類神經遞質檢測 PD組大鼠腦部紋狀體細胞外液中單胺類神經遞質的色譜分離圖，各物質在30 min內能完全分離出來，見圖2。

圖2 PD組大鼠腦紋狀體微透析液中單胺類神經遞質的色譜分離圖

2.3 3組大鼠腦部紋狀體中單胺類神經遞質的檢測 與假手術組相比，PD組腦部損傷側紋狀體細胞外液中的DA、DOPAC、HVA、NE、E、5-HT和5-HIAA含量在造模4周后均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與PD組相比，PD+L6H3組的DA、NE和E含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）后明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與PD組相比，PD+L6H3組的DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 造模后第4周、第5、第6周（給藥后第1、第2周）及第7周（停藥后第1 周）3 組大鼠紋狀體中單胺類神經遞質的變化

3 討論

PD手術治療費用昂貴，目前還是以藥物治療為主。如臨床上較常使用的左旋多巴，只能通過外源性補充腦內DA，緩解PD癥狀，但其不能改善DA能神經元變性，對疾病的進程沒有治療作用。近年來，PD藥物治療由直接補充DA轉向多環節治療，重點集中于對DA能神經元的保護作用。

姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取的具有α，β-不飽和二酮的化合物[2]。該天然產物表現出降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護DA能神經元等功能[5]，但姜黃素也具有穩定性差、生物利用度低、不能通過血腦屏障等不能成藥的缺點[6]。L6H3是去除姜黃素結構中不穩定的β-二酮基團，同時保留了姜黃素的有效治療基團的姜黃素類似物。L6H3能順利通過血腦屏障，具有不受給藥途徑限制的優點。本研究表明，L6H3能提高PD大鼠腦紋狀體中單胺類神經遞質及其相關代謝產物的產量，顯示其可能具有DA能神經元保護作用，具體的作用機制有待進一步研究。

單胺類神經遞質是調控機體生物活動的重要物質，也是中樞神經系統中發揮信息傳遞的物質。目前研究認為，PD病理表現的DA能神經元變性、死亡，導致腦內多種神經遞質失衡，其中在黑質-紋狀體通路以DA為代表的單胺類神經遞質變化最為顯著。NE是由腦內腎上腺素能神經末梢合成及分泌的神經遞質，PD患者血清中NE的含量較低[7]。5-HT作為神經遞質參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能調節。有研究顯示[8]，PD患者腦中5-HT出現輕到中度的降低，而持續性的5-HT降低可增加PD患者抑郁癥狀的發生。目前已有大量研究通過檢測紋狀體區域的單胺類神經遞質作為PD的病理生理狀態的評估[9]。

測定單胺類神經遞質常用的方法有熒光法、放射酶學法、毛細血管電泳法和高效液相色譜法等。熒光法存在樣品前處理復雜、結果重復性差等缺點。放射酶學法有較高的靈敏度，而操作條件嚴苛、技術難度高以及檢測速度慢等缺點限制其使用與推廣；色譜法具有分離效率高、選擇性好的特點；電化學檢測器具有靈敏度高、重現性好的特點。較HPLC-UV和HPLC-熒光，HPLC-ECD聯用后靈敏度更高、檢出值更低，更適用于檢測腦組織中微量的單胺類神經遞質及其代謝產物的含量[10]。目前HPLC-ECD已被廣泛應用于檢測實驗動物腦中以及臨床患者腦脊液中神經遞質的含量，并且能夠同時檢測多種單胺類神經遞質。

由于單胺類神經遞質及其代謝產物在腦中的含量極少，且對光、熱均不穩定，有效的樣品處理方法同樣是測定腦中神經遞質的關鍵。而當前大多檢測動物實驗樣品均是從已死亡的腦組織中提取的組織液，如液氮凍斃后的蜜蜂腦組織勻漿液[9]、大鼠腦組織勻漿液[11]、家兔腦組織勻漿液。動物的麻醉狀態及后期樣品的收集過程，都會對組織液中神經遞質產生變化，因而其結果并不能真實地反映神經遞質的變化。微透析活體取樣為一種新型生物采樣技術，它是通過將一個尖端帶有可透過小分子物質的半透膜探針插入活體動物組織進行生物采樣，能夠在不影響動物正常生理活動的情況下收集生理活性樣品，幫助動態研究生物體的某些生化物質的變化[12]。該方法收集的樣品已直接排除蛋白質等大分子的干擾，具有處理操作快速簡單的優點[13-14]，能在最大程度上保留樣品中神經遞質含量。也有研究報道測量血漿[15]、尿液[16]中單胺類神經遞質含量，但這只是通過檢測神經遞質代謝后的含量來間接反映神經遞質釋放情況；而紋狀體微透析液中的細胞外神經遞質主要來自于神經末梢的釋放，因此紋狀體細胞外液能夠直接反映神經遞質的釋放情況。將微透析活體取樣與HPLC-ECD相結合具有靈敏度高、分離有效和所需樣品量小等特點。本研究采用微滲透活體取樣與HPLC-ECD聯用檢測大鼠腦部紋狀體細胞外液中7種單胺類神經遞質及其代謝物，結果顯示，6-OHDA造模后腦部紋狀體細胞外液中單胺類神經遞質及其代謝物的含量顯著降低，再次驗證了PD腦紋狀體中單胺類神經遞質的含量降低。給予L6H3 2周后，L6H3能使單胺類神經遞質及其代謝物的含量升高。單胺類神經遞質的變化是遞質代謝疾病PD研究治療藥物的指標。更值得注意的是，在L6H3停藥1周后單胺類神經遞質及其代謝物的含量沒有因為停藥而降低，而是保持增加趨勢，說明L6H3的治療作用可能不是單純的通過給藥時上調單胺類神經遞質含量，可能是通過發揮其DA能神經元的修復作用，其主要作用機制也值得進一步深入研究。