利用單顆粒氣溶膠質譜儀分析細菌氣溶膠顆粒

曾真 喻佳俊 劉平 黃福桂 陳穎 黃正旭 高偉 李梅 周振 李磊

摘 要 ：大氣中懸浮的活性生物氣溶膠通過人的呼吸系統進入人體內，會對人體的健康造成一定影響，因此活性生物氣溶膠的檢測極其重要。近年來，越來越多的研究嘗試將單顆粒氣溶膠質譜（SPAMS）技術應用于大氣生物氣溶膠監控領域。本研究利用SPAMS對13株已知菌株進行分析檢測發現，不同活性細菌氣溶膠的單細胞譜圖之間具有較高的一致性，因此較難對菌株進行鑒定。但是，活性細菌氣溶膠的常見峰與大氣其它細顆粒的特征峰有較大差異，如活細菌氣溶膠存在m/z 30、70、72、74、86、88、110和120等氨基酸碎片離子峰，以及m/z-26、42、79、97和159等氰酸和磷酸鹽離子峰。進一步對外場大氣氣溶膠進行檢測發現，上述負離子峰較穩定，可作為細菌氣溶膠的特征峰，實現快速在線識別活性細菌氣溶膠的目的。

關鍵詞 ：單顆粒氣溶膠質譜儀; 活性生物氣溶膠; 在線識別

1 引 言

大氣中的生物氣溶膠通過人的呼吸進入體內，對人類健康形成潛在危害。此外，生物氣溶膠還可作為云凝結核，參與云的形成，從而對氣候產生重要影響。生物氣溶膠在大氣中的數量比例可達30%以上[1]，當空氣中具有傳染性的活性生物氣溶膠達到一定濃度時，極易導致傳染性疾病的大規模爆發。因此，建立快速的大氣活性生物氣溶膠檢測與鑒定的方法極為重要。

常見的生物氣溶膠實時在線檢測方法是基于熒光檢測的光學粒子計數器法[2]。由于生物體內的某些蛋白在特定波長的激光照射下會激發熒光，通過對熒光信號的檢測顆粒物的生物活性， 從而達到生物氣溶膠的鑒別目標。然而，這種檢測技術僅能通過熒光信息進行判斷，一方面，不同生物氣溶膠種類對激光波長的選擇不一致;另一方面，基于熒光的檢測易受到無機物的干擾，導致誤判。研究表明，多環芳香族碳氫化合物（PAH）也具有類似生物氣溶膠的熒光特性[3]，因此，在PAH濃度較高的區域難以實現生物氣溶膠的區分與識別。此外，香煙煙霧等也會產生與生物細菌相類似的熒光特性。單顆粒氣溶膠質譜（SPAMS）[4]是一種能夠實時分析單個氣溶膠顆粒物粒徑與化學組成的方法，通過獲取每個氣溶膠顆粒物的質譜指紋圖譜，即可實現氣溶膠顆粒物的定性與來源分析。近年來，SPAMS的生物氣溶膠檢測技術得到較快發展。Stowers等[5]開發了熒光預篩選單顆粒質譜儀，通過熒光法篩選出潛在的生物氣溶膠顆粒，然后經過激光解離質譜進行檢測。 McJimpsey等[6，7]改進了氣溶膠飛行時間質譜儀（ATOFMS）的結構，可實時在線原位檢測空氣病原微生物和生化戰劑。 Zawadowicz等[8]發現，此前作為生物氣溶膠識別峰的CN、CNO、PO2、PO3離子峰在含磷礦物粉塵和富磷燃燒副產物的負譜圖中也很常見，因此容易在鑒定時混淆，而新開發的機器學習算法可通過計算譜圖中CN/CNO與PO2/PO3的比例， 較為準確地區分生物氣溶膠與其它揚塵。Steele等[9]檢測了枯草芽孢桿菌黑色變種，從獲得的單顆粒譜圖分析主要離子峰來源于精氨酸、吡啶二羧酸及聚谷氨酸，但由于能量的影響，單個顆粒間的譜圖存在差異，導致難以區分相近的芽孢桿菌種。Fergenson等[0]采用生物氣溶膠質譜儀，利用特征離子峰成功將蘇云金芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌從其它生物和非生物環境中辨別出來。Tobias等[1]利用單顆粒質譜儀檢測了H37Ra結核分枝桿菌，并根據特征離子峰將其成功與恥垢分枝桿菌和蠟樣芽孢桿菌區分開。隨著商品化SPAMS的普及，利用SPAMS開展氣溶膠研究的工作逐年增多，包括表征不同排放源的質譜指紋圖譜、大氣顆粒物來源解析和大氣化學過程研究[2～14]等，但國內還未有利用該儀器分析生物氣溶膠的研究。

本研究利用自行開發的高性能SPAMS，對13株已知菌株進行檢測，嘗試尋找生物細菌的單顆粒質譜指紋特征，以此作為空氣中活性細菌氣溶膠的識別峰。

2 實驗部分

2.1 SPAMS

單顆粒氣溶膠質譜儀為廣州禾信開發的商品化的SPAMS 0525[5]。 簡言之，SPAMS利用空氣動力學透鏡將氣溶膠從大氣環境引入到真空系統并聚焦成準直顆粒束，隨后兩束連續激光用于測定顆粒物的飛行速度，并依此計算顆粒物的空氣動力學直徑。高能量的脈沖激光器在顆粒物達到離子源中心處將顆粒物電離成正負離子，用飛行時間質譜進行檢測。本研究使用的SPAMS在原有的基礎上進行了性能的提升，一方面，采用延遲引出技術[6]提高了飛行時間質譜儀的分辨率;另一方面，采用多通道疊加的信號采集系統[7]實現大、小信號同時檢測，大幅提升了儀器檢測的靈敏度和動態范圍。

2.2 生物細菌采樣

本研究檢測的13株細菌中有8株細菌采自廣州市黃埔區開發區加速器產業園區食堂，并利用16S rRNA測序技術（蘇州金唯智生物科技有限公司）進行鑒定，分別為藤黃微球菌、頭狀葡萄球菌、克氏庫克菌、科氏葡萄球菌、西宮皮生菌、人葡萄球菌、海生庫克菌、溶血葡萄球菌。另外5株標準菌株購自廣東省微生物研究所，分別為惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸沙門氏菌、宋氏志賀氏菌。

2.3 細菌檢測

取保存的13株細菌，在LB固體培養基上進行復壯培養，后轉接單菌落至LB液體培養基（Solarbio， L1010，中國）培養24 h。取50 mL渾濁LB液體培養基，以6000 r/min離心15 min，沉淀即為純菌體。利用滅菌蒸餾水（MilliQ純水儀）將純菌體清洗3次，然后加入30 mL滅菌純水，混勻后倒入9302A氣溶膠發生器（美國TSI公司）中。氣溶膠發生器產生的細菌單顆粒氣溶膠經擴散干燥管干燥后進入SPAMS進行檢測。SPAMS采集的粒徑范圍為0.1～5.0 μm，分辨率達到1200，質譜測量范圍為m/z50～+250， 每株細菌收集742張譜圖。細菌檢測流程見圖1。

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