分子印跡光子晶體凝膠膜可視化檢測葡萄酒中鄰氨基苯甲酸甲酯

吳偉珍 黃夢霞 黃慶達 呂彩華 賴家平 孫慧

摘 要 ：鄰氨基苯甲酸甲酯（Methylanthranilate， MA）是我國禁止在葡萄酒中添加的香料，對MA測定是葡萄酒中重要的質控環節。因此，開發快速檢測葡萄酒中違禁香料的方法具有重要的實際意義。本研究利用分子印跡技術與光子晶體技術相結合，以MA為模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）為交聯劑，在60℃加熱條件下引發聚合，去除光子晶體模板和洗脫印跡分子后得到反蛋白石結構分子印跡光子晶體凝膠膜。研究結果表明，此印跡凝膠膜對MA分子有較好的選擇性，在分子識別過程中MA印跡凝膠膜的Bragg衍射峰位置隨著MA濃度的增大而發生紅移，達到平衡狀態的時間為6 min，且偏移值（Δλ）與MA的濃度（C）在0.1～10.0 mmol/L范圍內有良好的線性關系，檢出限為31 μmol/L，可實現重復循環檢測使用。此外，在檢測不同濃度印跡分子時，肉眼能夠觀察到印跡凝膠膜顏色的變化。此智能型凝膠膜可望用于葡萄酒中MA的可視化快速檢測。

關鍵詞 ：分子印跡; 光子晶體; 可視化檢測; 鄰氨基苯甲酸甲酯

1 引 言

在葡萄酒生產中，有些不法商家為了追求利益，非法添加甜味劑、葡萄香精等違禁品。我國國家標準（GB150372006《葡萄酒》）已明確規定，任何葡萄酒產品都不能添加香精。葡萄香精主要由香料分子和助劑配制而成，其中香料分子主要是鄰氨基苯羧酸酯類，如常見的鄰氨基苯甲酸甲酯（MA）[1]。因此，對葡萄酒中香料分子的檢測是葡萄酒的重要質控環節。

目前，關于葡萄酒中香料檢測方法的報道不多，實際檢測時仍主要靠感官品評的方法判斷，準確性不高[2]，而標準的檢測方法主要集中于色譜法[3]。雖然色譜檢測結果準確可靠，適用范圍廣，但是也存在很多不足，如樣品前處理過程復雜，所需儀器價格比較昂貴且笨重，不適于現場的快速檢測，使用受限?；诖?，開發方便快捷、靈敏專一的現場檢測葡萄酒中香料的方法具有極其重要的意義。

光子晶體是具有不同介電常數（折射率）的介質在空間排列形成有序結構的材料，又稱光子禁帶材料，具有獨特的光學性能，在光學傳感領域應用廣泛 [4～10]。分子印跡聚合物是一種對目標分子具有特異性識別的材料[113]。將分子印跡技術引進光子晶體傳感材料中，可構建出既有光子晶體光學特性，又有分子印跡聚合物特異性識別能力的凝膠傳感膜。這種凝膠傳感膜在分子識別的過程中會引起光子帶隙的位置移動，即無需信號轉換原件即可將分子的識別過程直接通過光子晶體的光學信號表達出來，如偏移足夠大，則能直接用肉眼觀察到顏色的變化，從而達到可視化檢測的目的。因此，這種傳感材料在分析檢測上具有一定的優勢[4，15]。近年來，清華大學李廣濤課題組將該材料成功應用于多巴胺、油酸的可視化檢測[6，17]。隨后，研究者還將該材料應用于環境內分泌干擾物[8，19]、氨基酸[20，21]、農藥[22，23]、抗生素[24～28]、炸藥分子[29]、金屬離子[30，31]等的快速識別檢測，證明了該類傳感材料在分析檢測中的可行性。目前，檢測香料分子的分子印跡光子晶體凝膠傳感膜的制備及應用尚未見報道?；诖耍狙芯恳韵懔戏肿余彴被郊姿峒柞橛≯E分子，構建出一種智能型分子印跡光子晶體凝膠傳感膜，用于葡萄酒中鄰氨基苯甲酸甲酯的可視化快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

JSM7001F掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）; USB2500+光纖光譜儀（美國海洋光學）; H1850臺式高速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）; SHABA數顯水浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）; XW80A渦旋混合器（上海精科實業有限公司）; KH300DE數控超聲波清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）; PHS3C型pH計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）;? WS01恒溫恒濕培養箱（黃石市恒豐醫療器械有限公司）。

對氨基苯甲酸甲酯、MA、對羥基苯甲酸甲酯（分析純，麥克林試劑公司）; 甲基丙烯酸（MAA）、鄰氨基苯甲酸（分析純，阿拉丁試劑公司）; 偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，天津大茂化學試劑廠）; 甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，分析純，北京百靈威科技有限公司）; HF（45%，廣州化學試劑廠）; H2O2（30%，廣州化學試劑廠）; 其它試劑均為分析純; 有機玻璃片（PMMA，購于當地廠家）。

2.2 實驗方法

2.2.1 SiO2微球的合成及光子晶體模板的制備 SiO2微球的制備是根據經典的Stber法并稍做改進：在250 mL潔凈干燥的錐形瓶中依次加入16 mL無水乙醇、25 mL去離子水和9 mL氨水，以1100 r/min磁力攪拌使溶液混合均勻，再迅速加入3 mL TEOS和45 mL無水乙醇組成的混合液，攪拌2 min后， 將攪拌速度調至400 r/min，室溫下繼續反應2 h。反應結束后得到乳白色懸濁液，以3500 r/min離心10 min， 得到SiO2微球，并用無水乙醇重復洗滌3～4次。將微球超聲分散在無水乙醇中，得到SiO2微球分散液。

光子晶體的制備采用垂直沉降自組裝的方法：取4 mL上述制得的SiO2微球分散液至7 mL西林瓶中，再將經過食人魚羥基化處理后的干燥載玻片垂直插入西林瓶中，放置在溫度30℃、濕度45%的恒溫恒濕生化培養箱中，無水乙醇揮發干后，在載玻片的表面得到有序排列蛋白石結構的光子晶體模板。

2.2.2 MA分子印跡光子晶體凝膠（MIPHs）膜的制備及條件優化 將適量MA、MAA、EGDMA溶于甲醇中，超聲混勻，避光靜置過夜，進行預組裝，使模板分子與功能單體之間充分形成氫鍵作用。加入5 mg引發劑AIBN，通氮氣5 min。取兩片干凈的有機玻璃片分別覆蓋在光子晶體模板表面并夾緊，類似三明治結構。取適量上述配制好的預聚液緩慢注入三明治結構的縫隙中，使其充滿，在無氧的狀態下，于60℃的水浴中熱聚合反應4 h。反應結束后，將三明治結構的夾層浸泡在1% HF溶液中，使載玻片和有機玻璃片分離，再將脫落后的有機玻璃片浸泡在4% HF溶液約3 h，以充分除去有機玻璃片表面附著的SiO2，最終得到反蛋白石結構的凝膠膜。用一定體積比例的甲醇水醋酸洗脫液浸泡凝膠膜以洗脫模板分子，即得到MAMIPHs膜，制備過程如圖1所示。在不加模板分子的情況下，采用相同的方法制備非印跡凝膠（NIPHs）膜。

2.2.3 MIPHs膜識別性能的考察 將MIPHs膜浸入含有一定濃度MA的20%甲醇溶液中進行吸附，吸附完成后，用微型光纖光譜儀記錄MIPHs膜在吸附前后布拉格衍射峰的位置，根據其布拉格衍射峰的變化情況，考察MIPHs膜對模板分子的響應性能。

3 結果與討論

3.1 SiO2微球及蛋白石結構光子晶體模板的表征

SiO2微球的粒徑大小、均勻性、分散性等因素對制備光子晶體模板有較大影響，本研究采用改進的Stber法合成得到SiO2微球。由SiO2微球和光子晶體模板的SEM圖（圖2）可見，制備得到的SiO2微球單分散性好、粒徑均一，且通過垂直沉降自組裝法制備得到的光子晶體模板排列整齊，呈現出面心立方緊密堆積的蛋白石結構。

3.2 MIPHs膜制備條件的優化

本研究制備的MIPHs膜的分子識別原理為：模板分子MA與功能單體在溶劑中通過氫鍵作用、靜電作用等相互作用形成復合物，在無氧、加熱的環境中，復合物與交聯劑在引發劑的作用下發生聚合反應，將模板分子洗脫后即得到相應的MA特異性識別位點，MA分子可通過該識別位點被選擇性地重新吸附到MIPHs膜中。因此，溶劑、功能單體、交聯劑等是MIPHs膜進行分子識別的重要影響因素。在MIPHs膜制備過程中，溶劑作為致孔劑，用量過多會造成印跡物結構的剛性強度降低，從而影響識別效果，而用量過少又會影響印跡物空腔結構的數量。同時，溶劑的極性對模板分子與功能單體之間氫鍵的形成也有一定的影響。因此，選擇合適的溶劑是制備MIPHs膜的關鍵。如圖3A所示，

當溶劑為0.2 mL甲醇時， MIPHs膜識別效果最好。MIPHs膜對模板分子的識別是否能夠轉化為可讀的光學信號，取決于膜可逆的溶脹收縮狀態，此特性與交聯劑用量相關，交聯劑用量過多，膜的剛性強度太大，難以發生溶脹收縮，而交聯劑用量過少，膜的柔韌性太大，難以形成穩定的三維有序孔狀結構，甚至失去光學信號。由圖3B可知，當模板分子與交聯劑的摩爾比為1∶1時印跡效果最佳。此外，分子印跡是通過功能單體與模板分子之間的氫鍵作用、靜電作用等實現特異性化學鍵吸附，因此，選擇合適功能單體將會提高印跡位點的數量、有效性、選擇性等。本研究考察了甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）作為功能單體時的情況（圖3C），當功能單體為0.5 mmol MAA時，印跡識別效果最好。在選定的最優條件下制備MIPHs膜，由圖3D可知，制得的MIPHs膜具有高度有序的反蛋白石結構。

3.3 MIPHs膜對MA的響應時間

制備得到的MIPHs膜具有三維高度有序的 多孔結構，其中分布著豐富的特異性識別位點，在目標分子響應的過程中，引起光子晶體凝膠膜體積發生溶脹或收縮，在一定時間內達到平衡狀態。基于此，將MIPHs膜插入到10 mmol/L MA的20% （V/V）甲醇溶液中進行吸附，實驗結果如圖4所示，當響應時間為6 min時，已基本達到吸附平衡狀態。

3.4 MIPHs膜對MA的傳感性能

為了研究MIPHs膜對MA的傳感性能，將MIPHs膜浸泡在一系列不同濃度的MA溶液中進行吸附，測定吸附前后布拉格衍射峰的位置。如圖5A所示，隨著MA濃度增大，凝膠膜的布拉格衍射峰發生紅移，這是因為MIPHs膜選擇性吸附MA，在一定程度上也增大了離子強度，使MIPHs膜的晶格結構脹大，最終導致布拉格衍射峰發生紅移。由圖5B可知，布拉格衍射峰偏移值（Δλ）與MA分子的濃度在0.1～10.0 mmol/L范圍內具有很良好的線性關系，可用于對MA的定量檢測，檢出限為31 μmol/L（S/N=3）。由圖5C可見，檢測不同濃度MA時，肉眼可觀察到印跡凝膠膜顏色的變化，表明此智能型凝膠膜可用于MA的可視化快速檢測。如圖5D所示，當NIPHs膜浸泡在不同濃度的MA溶液進行吸附，NIPHs膜的布拉格衍射峰偏移量不大，這是由于NIPHs膜不具有印跡位點，這也進一步驗證了MIPHs膜對MA具有特異性識別作用。

3.5 MIPHs膜的選擇性

以結構相似的鄰氨基苯甲酸、對氨基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯為參照，考察了MIPHs膜對MA的特異性識別性能。如圖6所示，MIPHs膜在對MA測定時較為靈敏，布拉格衍射峰移動明顯，而測定結構類似的其它3種分子時，MIPHs膜的布拉格衍射峰移動不明顯，表明制備的MIPHs膜對MA具有良好的選擇性。

3.6 MIPHs膜的重復使用性性能

采用同一片MIPHs膜進行重復性實驗，將MIPHs膜浸泡在10 mmol/L MA的20%甲醇溶液中，吸附平衡后，用光纖光譜儀進行檢測，然后用洗脫液洗脫模板分子再進行吸附，如此重復10次，該MIPHs膜對MA均有較好的響應性（圖7），表明本方法制備的MIPHs膜易于循環再生，重復使用性能良好，能夠實現多次重復使用。

3.7 葡萄酒中MA含量的測定

為了驗證本方法對實際樣品的分析性能，采用本方法檢測了國產蛇龍珠葡萄酒和赤霞珠葡萄酒，二者均未檢出MA。將葡萄酒稀釋5倍后，分別添加0.8、5.0 和8.0 mmol/L的MA，采用本方法檢測，加標回收率在91%～101%之間（表1），表明本方法在葡萄酒質控中具有潛在的實用性。

4 結 論

將光子晶體技術與分子印跡技術結合，對制備條件進行優化，成功制備出具有反蛋白石結構的分子印跡光子晶體凝膠膜。此凝膠膜對目標分子MA具有良好的選擇性，且可重復使用，可實現對目標分子的可視化半定量檢測，具有快速、簡便、可高效現場檢測的優勢。 本方法在葡萄酒質控中有良好的應用潛能。

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Abstract Methylanthranilate （MA） is a kind of spice illegally added in the wine in China. The determination of MA in wine is an important quality control link. Therefore， it is of great significance to develop a rapid method for detection of prohibited spice in wine. In this work， an inverse opal structural molecularly imprinted photonic hydrogels （MIPHs） membrane was fabricated by using the photonic crystal techniques and molecular imprinting techniques. The MIPHs membrane was prepared by using methylanthranilate as template molecule， methacrylic acid as functional monomer， ethylene glycol dimethacrylate as cross linker， followed by a thermal polymerization at 60℃. Then the inverse opal structural MIPHs membrane was obtained after removing photonic crystal template and imprinted molecules. The results showed that the MIPHs membrane exhibited a good selectivity property to MA， and it responded to MA within 6 min. The Bragg diffraction peak shifted with increasing concentration of MA. A linear relationship was found between Δλ and the concentration of MA in the range from 0.1 mmol/L to 10 mmol/L. And the least detectable concentration was about 31 μmol/L. Furthermore， a color change of the MIPHs membrane couldbe observed by naked eyes. Therefore， the smart MIPHs membrane showed great potential in rapid and visual detection of MA in wine.

Keywords Molecular imprinting; Photonic crystal; Visual detection; Methylanthranilate