PFKFB3在缺氧條件下調(diào)節(jié)血管新生的作用

鄒 蓉(綜述) 袁源智(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科 上海 200032)

血管新生相關(guān)的疾病(如眼疾、癌癥等)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)等眼部視網(wǎng)膜血管新生引起的視力下降甚至喪失,是發(fā)達(dá)國(guó)家中青年勞動(dòng)力致盲的主要原因[1]。目前臨床上已經(jīng)將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)途徑的靶向藥物(如貝伐單抗、雷珠單抗、康柏西普等)用于抗血管新生治療,但是長(zhǎng)期眼部抑制VEGF或會(huì)引起神經(jīng)元毒性和一些眼部并發(fā)癥[2-3],為進(jìn)一步了解血管新生的生理學(xué)和病理學(xué)機(jī)制,并尋找更有效的治療靶點(diǎn),本文對(duì)最近發(fā)現(xiàn)的糖酵解過(guò)程中生理性和病理性血管新生作用進(jìn)行總結(jié),首先介紹糖酵解的重要調(diào)節(jié)劑6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)在不同情況下的表達(dá)水平的改變及其調(diào)節(jié)機(jī)制,然后介紹PFKFB3調(diào)節(jié)的糖酵解過(guò)程對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響,并由此討論其對(duì)血管新生過(guò)程的影響。

PFKFB3在缺氧條件下的表達(dá)缺氧是多種疾病共有的病理生理特點(diǎn),尤其是病理性血管新生性疾病[4-5]。在缺氧期間細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕刻墙徒獯x來(lái)以滿(mǎn)足其能量需求。這種代謝途徑的轉(zhuǎn)變是否在血管新生過(guò)程中具有某種作用,尚不清楚。PFKFB3也是糖酵解通量的重要控制因素。PFKFB3基因位于染色體10p15-p14[6],基因中至少含有19個(gè)外顯子,并且由于COOH-末端的可變區(qū)可以進(jìn)行可變剪接,所以目前在人中至少發(fā)現(xiàn)了6種分別具有不同組織選擇性的結(jié)構(gòu)同種型——UBI2K1～6[7]。該基因編碼的蛋白質(zhì)PFKFB3,屬于雙功能酶家族(PFKFB1-4),該家族蛋白在氨基末端含有激酶結(jié)構(gòu)域6-磷酸果糖-2-激酶(6-phosphofructo-2-kinase,PFK-2)以及在羧基末端含有雙磷酸酶結(jié)構(gòu)域果糖-2,6-二磷酸酶(fructose-2,6-bisphosphatase 2,FBPase-2),并通過(guò)PFK-2催化2,6-二磷酸果糖的合成;通過(guò)FBPase-2催化其分解,當(dāng)兩者平衡調(diào)節(jié)時(shí),2,6-二磷酸果糖(fructose 2,6-diphosphate,F2,6BP)在體內(nèi)的濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)[8]。在體內(nèi)F2,6BP不僅是糖酵解關(guān)鍵酶PFK-1的變構(gòu)激活劑,也是果糖1,6-二磷酸酶(FBPase-1)的抑制劑[9-10](圖1)。由于PFKFB3缺乏像PFKFB1的Ser32磷酸化位點(diǎn)[11],無(wú)法通過(guò)該位點(diǎn)的磷酸化下調(diào)激酶活性,所以PFKFB3的激酶/磷酸酶活性的比例比其他家族成員高[12]。已知在PFKFB3基因的增強(qiáng)子區(qū)域中含有2個(gè)拷貝的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)結(jié)合基序(5’-ACGTG-3’)[13],在缺氧條件下通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)PFKFB3表達(dá)上調(diào)[14]。

There are two different domains at the amino terminus and the carboxy terminus,which is the structural feature of the bifunctional enzyme.The amino-terminal kinase domain PFK-2 is capable to catalyze the synthesis of F2,6BP,while the carboxy-terminal diphosphatase domain FBPase-2 is responsible for catalyzing the decomposition of F2,6BP,which is the functional feature of the bifunctional enzyme.F2,6BP:Fructose 2,6-diphosphate.
圖1 雙功能酶的結(jié)構(gòu)和功能
Fig 1 Structure and functions of the bifunctional enzyme

PFKFB3的其他調(diào)節(jié)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高糖酵解代謝,并且當(dāng)腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中PFKFB3等位基因中的一個(gè)拷貝失活,或者在阻斷PFKFB3的作用時(shí),可以通過(guò)使腫瘤組織的血管正常化來(lái)減少癌細(xì)胞的侵襲,血管內(nèi)滲和轉(zhuǎn)移[15]。PFKFB3在人類(lèi)多種腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平都較正常組織和細(xì)胞要高,并且與HIF-1α水平有關(guān)[16-17]。PFKFB3分子中含有多個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),包括s461、s467和s478等。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧、高滲透壓等應(yīng)激狀態(tài)時(shí),可以通過(guò)激活p38/MK2、MAPK、ERK/RSK等激酶的作用,對(duì)PFKFB3進(jìn)行磷酸化,從而增強(qiáng)PFKFB3激酶活性,提高糖酵解通量以適應(yīng)細(xì)胞增殖的能量需求[18-20]。在其mRNA的3’非編碼區(qū)中,存在多個(gè)拷貝的AUUUA序列,使得mRNA不穩(wěn)定,可以被多種調(diào)節(jié)因素改變蛋白的表達(dá)水平[21]。miR-206和miR-26a、miR-26b、miR-449c等微小核苷酸還可以通過(guò)直接與該3’-UTR相互作用抑制PFKFB3的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[22-24]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1β(transforming growth factor beta 1,TGF-1β)、雌二醇和胰島素等通過(guò)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)PFKFB3的轉(zhuǎn)錄活性,提高蛋白表達(dá)水平[19,25-26](圖2)。

In the nucleus,estradiol regulates PFKFB3 gene transcription via ER,high osmotic pressure through the P38/MK2/SRF pathway and hypoxia through the MAPK/HIF-1 pathway.MiR-26a,miR-26b,miR-206,miR-449c affect the translation by direct interaction with PFKFB3 mRNA.Kinases MK2 and MAPK can also play a role in affecting the phosphorylation of PFKFB3 protein;APC/C-Cdk-1 exerts its function by directly degrading PFKFB3.When these factors affect the synthesis or function of PFKFB3 protein,it will have an effect on the glycolysis process.
圖2 PFKFB3的調(diào)節(jié)機(jī)制和功能
Fig 2 Function and mechanism of PFKFB3

PFKFB3的生物學(xué)功能PFKFB3表達(dá)增高促進(jìn)糖酵解通量增加,乳酸增多,高水平乳酸可刺激血管新生。PFKFB3還可定位到核內(nèi),通過(guò)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶,如細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶1(cyclin dependent kinase 1,Cdk-1),促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[27]。泛素蛋白酶體途徑是目前已知的、所有真核生物體內(nèi)具有的高度選擇性的、重要的蛋白質(zhì)降解途徑,泛素連接酶APC/C-Cdk-1可以通過(guò)促進(jìn)PFKFB3泛素化降解,降低細(xì)胞的糖酵解,減少進(jìn)入S期的細(xì)胞,抑制細(xì)胞增殖[28]。此外,APC/C-Cdk-1通過(guò)降解PFKFB3抑制糖酵解途徑,促進(jìn)磷酸戊糖途徑,細(xì)胞中還原型谷胱甘肽合成增多,細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)[28](圖2)。

內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解與血管新生

糖酵解參與調(diào)節(jié)血管新生 最近有研究證明人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中約80%的ATP是通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生的,即使在正常氧分壓下,血管內(nèi)皮細(xì)胞也主要利用葡萄糖進(jìn)行糖酵解產(chǎn)能[29-30]。雖然血管內(nèi)皮細(xì)胞與循環(huán)系統(tǒng)中的氧氣有密切的接觸,但是由于細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量少、體積小,并且為了能將更多的氧氣供給遠(yuǎn)處的組織、細(xì)胞,所以?xún)?nèi)皮細(xì)胞的代謝主要是糖酵解。在成年人中血管是相對(duì)靜止的,很少形成新的分支;但是血管內(nèi)皮細(xì)胞卻保持很高的可塑性,可以敏銳感知微環(huán)境中的血管生成信號(hào),如VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGR)等信號(hào)分子,并對(duì)其做出反應(yīng)。這種改變不僅僅包括分子方面的改變,細(xì)胞對(duì)能量的需求也在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生了很大變化[31]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧時(shí),己糖激酶活性和膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)被提高,促進(jìn)了18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)攝取和乳酸的產(chǎn)生[32]。這表明內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解代謝過(guò)程可能在血管新生中發(fā)揮重要作用。

PFKFB3通過(guò)影響發(fā)芽過(guò)程影響血管新生 近期有報(bào)道發(fā)現(xiàn)細(xì)胞糖酵解過(guò)程及其調(diào)節(jié)劑PFKFB3在血管新生過(guò)程尤其是發(fā)芽過(guò)程中具有重要作用[29]。原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)和小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PFKFB3在體外可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,PFKFB3基因缺陷小鼠體內(nèi)的血管存在缺陷;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PFKFB3主要調(diào)節(jié)血管發(fā)芽過(guò)程,即主要對(duì)Notch-DLL4信號(hào)通路介導(dǎo)的尖端細(xì)胞和莖細(xì)胞的行為進(jìn)行調(diào)控。內(nèi)皮細(xì)胞中的PFKFB3基因沉默時(shí),細(xì)胞形成較小且不規(guī)則的片狀偽足,絲狀偽足更少、更短,尖端細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力受限,無(wú)法引導(dǎo)血管發(fā)芽。該研究者還發(fā)現(xiàn),發(fā)芽誘導(dǎo)信號(hào)VEGF,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)等增加PFKFB3表達(dá)和糖酵解,而發(fā)芽限制信號(hào)DLL4(激活Notch)引起相反的效應(yīng);但是,PFKFB3蛋白表達(dá)改變時(shí)卻并沒(méi)有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中這些分子的表達(dá)[29](圖3)。這可能是因?yàn)镻FKFB3引起的糖酵解增加主要是為尖端細(xì)胞和莖細(xì)胞遷移時(shí)肌動(dòng)蛋白的活動(dòng)提供ATP[33]。因此,內(nèi)皮細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)可以作為獨(dú)立于血管新生分子調(diào)節(jié)機(jī)制之外的另一個(gè)抗血管新生治療的靶點(diǎn)[34]。

The VEGF pathway and the FGF2 pathway can promote the expression ofPFKFB3 gene,while the DLL4 signal can inhibit the expression ofPFKFB3 gene,thereby affecting the level of glycolysis in endothelial cells.
圖3 血管新生相關(guān)通路對(duì)PFKFB3的調(diào)節(jié)
Fig 3 Regulation of PFKFB3 by angiogenesis-related pathways

PFKFB3抑制劑對(duì)生理性和病理性血管新生具有抑制作用 最近研究表明,次優(yōu)劑量的PFKFB3拮抗劑,即小分子3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮(3PO)和VEGFR抑制劑SU5416單獨(dú)作用于斑馬魚(yú)胚胎時(shí),對(duì)椎血管發(fā)育的損傷很小,但是二者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)胚胎中椎血管的損傷加重,高劑量SU5416聯(lián)合3PO時(shí)可以廢除幾乎所有胚胎中椎血管的發(fā)育[35]。在激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的小鼠模型中,3PO可以劑量依賴(lài)性地降低CNV損傷體積,并且增加VEGFR2單克隆抗體DC101的抗血管生成活性,當(dāng)使用次優(yōu)劑量的DC101時(shí),CNV面積減少38%,而DC101與3PO的組合導(dǎo)致CNV面積減少67%[35]。與CNV一樣,早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的氧誘導(dǎo)小鼠模型主要病變也是病理性血管新生。 在出生后12天(post-natal 12 day,P12)至17天(post-natal 17 day,P17)的血管增殖期間用3PO處理幼崽,P17血管簇形成減少[35]。已知內(nèi)源性雌激素17β-雌二醇(E2)也是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子[36-37]。雌激素通過(guò)選擇性G蛋白偶聯(lián)雌激素受體介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,該過(guò)程必需有PFKFB3參與,這為雌激素受體誘導(dǎo)的病理性血管新生的治療提供了更多的思路[38]。

結(jié)語(yǔ)細(xì)胞代謝產(chǎn)生ATP以及其他中間產(chǎn)物是維持細(xì)胞生存和活動(dòng)的重要過(guò)程。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮糖酵解過(guò)程在病理性血管新生中有重要作用,主要是通過(guò)調(diào)節(jié)尖端細(xì)胞偽足形成和遷移能力促進(jìn)血管發(fā)芽。通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮異常糖酵解過(guò)程抑制異常血管新生,可能是治療眼部或者其他部位病理性血管新生的新方法。