miR-338-3p和MACC1基因在卵巢上皮性癌(EOC)組織中的表達及其意義

張瑞濤 史惠蓉 任 芳 劉哲穎 姬鵬程 張微微 王文文

(鄭州大學第一附屬醫院婦科 鄭州 450052)

微RNA(microRNAs,miRNAs)的突變和異常表達與各種人體腫瘤的發生發展相關,miRNAs能調控多種腫瘤相關基因的表達,可作為癌基因或抑癌基因而發揮作用[1]。在胃癌、結腸癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中miR-338-3p的表達水平明顯低于正常組織,miR-338-3p可能作為抑癌基因參與腫瘤侵襲和轉移[2-7]。MET轉錄調劑因子MACC1在結腸癌、胃癌、肺癌和肝細胞癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常,與腫瘤的侵襲和轉移關系密切,在晚期患者的腫瘤組織中表達明顯升高,可作為評價患者預后和轉歸的腫瘤標志物[8-11]。

研究表明,在胃癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中miR-338-3p可靶向調控MACC1基因,進而參與腫瘤的侵襲和轉移[12-14]。目前miR-338-3p在卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)組織中的表達情況及其與MACC1基因的相互關系尚不清楚。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測miR-338-3p和MACC1基因在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤及EOC中的表達情況,初步分析二者表達的相關性及其與卵巢癌臨床病理參數之間的關系,探討其臨床意義及其在卵巢癌發生發展中的作用。

資料和方法

組織標本和臨床資料收集鄭州大學第一附屬醫院婦科2012年10月至2015年10月間入組且隨訪資料完善的EOC患者105例,所有入組患者均因婦科疾病首次就診和接受治療,術前均無其他藥物和放射治療史,未合并其他器官或系統嚴重疾病或惡性腫瘤。不符合上述標準和妊娠的患者均予以排除。105例入組患者均留取手術新鮮卵巢組織標本,其中正常卵巢組織20例(標本來自因多發子宮肌瘤,或單側卵巢腫瘤且對側卵巢無受累,而接受子宮+雙附件切除術或單純雙附件切除術的患者),良性卵巢上皮性腫瘤組織20例(標本來自因良性卵巢腫瘤行卵巢囊腫剝除術或卵巢切除術的患者,其中漿液性囊腺瘤16例,黏液性囊腺瘤4例),初診EOC患者原發病灶組織65例。

65例EOC患者年齡28～76歲,中位年齡50歲。早期患者(Ⅰ～Ⅱ期)行全面分期手術,晚期患者(Ⅲ～Ⅳ期)行腫瘤細胞減滅術(殘余病灶<1 cm)。臨床分期(FIGO2014):Ⅰ期8例,Ⅱ期4例,Ⅲ期48例,Ⅳ期5例(其中腹壁肌層轉移灶2例,腹膜后非淋巴結轉移灶3例)。組織學分級:高級別38例,低級別27例。組織學類型:漿液性癌52例,黏液性癌13例。腹膜后淋巴結清掃均達到腸系膜下動脈水平,有淋巴結轉移者32例(其中僅盆腔淋巴結轉移者26例,僅腹主動脈旁淋巴結轉移者1例,兩處淋巴結均轉移者5例),無淋巴結轉移者33例。

本研究所有組織標本的收集和用途均獲得患者或家屬知情同意,并經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準。3組患者(正常、良性、癌)的年齡、BMI等一般資料差異無統計學意義。EOC患者術后依據臨床分期均接受規范化療(多西他賽聯合順鉑或卡鉑)3～6個療程,耐藥或復發患者采用二線化療藥物單藥或聯合化療(包含多西他賽、吉西他濱、依托泊苷、脂質體阿霉素、奧沙利鉑等)。

主要試劑Trizol(美國Invitrogen公司),TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司),RevertAid first strand cDNA合成試劑盒(加拿大Fermentas公司),SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)。

Real-time PCR檢測Trizol提取組織總RNA,純化后以分光光度計定量,取2 μg總RNA參照TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA模板,用于miR-338-3p表達的檢測,以U6作為內參。另取2 μg總RNA參照RevertAid first strand cDNA合成試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA模板,用于MACC1基因表達的檢測,以β-actin作為內參。逆轉錄產物參照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明書,采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行PCR反應,PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列見表1,PCR反應條件為:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,共40循環。每次PCR實驗重復3次,相對表達量用2-ΔΔCt表示。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

F:Forward;R:Reverse.

結 果

不同卵巢組織中miR-338-3p和MACC1基因的表達在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織和EOC組織中miR-338-3p的相對表達量分別為0.821±0.008、0.781±0.013和0.331±0.038,MACC1基因的相對表達量分別為0.059±0.011、0.315±0.034和0.774±0.025。與正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織相比(圖1),EOC組織中miR-338-3p表達水平明顯下調(F=77.916,P<0.001),MACC1基因表達水平明顯上調(F=77.945,P<0.001)。

不同性質卵巢組織中miR-338-3p和MACC1基因表達的相關性首先以TargetScan Human 7.1在線數據庫為基礎,查詢miRNA-靶基因調節關系,進而利用starBase V2.0 數據庫交互查詢5個權威miRNA靶標預測數據庫(TargetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda)中miRNA-靶基因調節關系的交集,顯示MACC1基因是miR-338-3p下游的靶向調節基因之一。本研究的105例不同性質卵巢組織經Spearman相關性分析顯示,miR-338-3p和MACC1的表達水平呈明顯負相關(r=-0.968,P<0.001,圖2)。

EOC組織中miR-338-3p和MACC1基因表達與臨床病理參數的關系65例EOC組織中miR-338-3p和MACC1的中位相對表達水平分別為0.320±0.014和0.782±0.033,據此劃分為相對高表達(≥中位表達量)和相對低表達(<中位表達量)。分組統計顯示,臨床分期越晚、組織級別越高、有淋巴結轉移的EOC組織中miR-338-3p表達越低而MACC1表達越高(表2)。

Log-rank和Cox回歸分析Log-rank單因素分析miR-338-3p表達、MACC1表達、年齡、臨床分期、組織分化、組織類型、腹水、淋巴結轉移等參數與65例EOC患者復發和死亡的關系,結果顯示miR-338-3p低表達(P=0.038,HR=4.139,95%CI:1.271～8.078)、臨床分期較晚(P=0.022,HR=2.346,95%CI:1.014～10.329)和淋巴結轉移(P=0.007,HR=5.032,95%CI:2.003～11.371)與EOC患者復發相關;miR-338-3p低表達(P=0.008,HR=3.007,95%CI:1.217～7.431)、臨床分期較晚(P=0.012,HR=3.678,95%CI:1.204～11.240)、組織分化高級別(P=0.029,HR=4.304,95%CI:1.742～10.630)和淋巴結有轉移(P=0.003,HR=4.432,95%CI:1.797～10.930)與EOC患者死亡相關。Cox多因素回歸分析顯示,上述因素均非EOC患者復發和死亡的獨立影響因素。

A:Real-time PCR;B and C:Relative expression.Normal:Normal ovarian;Benign:Benign epithelial ovarian tumor;Cancer:EOC.
圖1 不同卵巢組織中miR-338-3p和MACC1基因的表達
Fig 1 Expression of miR-338-3p andMACC1 gene in different ovarian tissues

表2 EOC組織中miR-338-3p和MACC1基因表達與臨床病理參數之間的關系Tab 2 The relationships between miR-338-3p and MACC1 gene expressions in EOC tissues and clinicopathological parameters of EOC [n (%)]

MACC1:High≥0.782±0.033;miR-338-3p:High≥0.320±0.014.(1)Fisher exact probability method.

圖2 不同卵巢組織中miR-338-3p和MACC1基因表達的相關性Fig 2 The correlation between miR-338-3p and MACC1 gene expression in different ovarian tissues

Kaplan-Meier生存分析截至2018年2月底隨訪結束時,入組患者隨訪時間為16～61個月,中位隨訪時間38個月,46人存活,19人死亡(表3)。在65例EOC患者中,miR-338-3p低表達同時MACC1高表達患者的總體生存率和無進展生存率均顯著低于其他類型患者(χ2=16.960,P=0.001;χ2=18.930,P=0.000)(圖3)。

表3 隨訪結束時65例EOC患者情況Tab 3 The status of 65 EOC patients at the end of follow-up (n)

A:Overall survival rate;B:Progression free survival rate.
圖3 EOC組織中miR-338-3p和MACC1表達與患者生存率的關系
Fig 3 Relationships between miR-338-3p and MACC1 expression in EOC tissues and survival rate of EOC patients

討 論

卵巢癌是威脅女性生殖健康的主要疾病之一,大部分患者發現時臨床分期較晚,盆腹腔存在癌灶廣泛侵犯和轉移是患者預后較差的重要原因之一。研究卵巢癌侵襲和轉移的分子機制,是卵巢癌基礎和臨床研究中的嚴峻課題。miRNAs是一種高度保守的內源性非編碼小RNA。人類基因組中有千余種miRNA,這些miRNA調控約1/3蛋白質編碼基因的表達,是最大的一類基因表達調控因子,在多種生理和病理過程中發揮重要作用[15]。miRNAs還與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、血管生成、腫瘤細胞微環境等惡性腫瘤侵襲和轉移相關過程關系密切,參與包括卵巢癌在內的多種惡性腫瘤的侵襲和轉移,可作為惡性腫瘤治療的潛在靶點[16-18]。

研究顯示,miR-338-3p在胃癌、結腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤組織中的表達水平明顯低于正常組織,可能作為抑癌基因參與上述惡性腫瘤的侵襲和轉移[2-7]。MACC1與多種惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關,本課題組前期采用免疫組織化學法、RT-PCR法和Western blot法研究顯示,EOC組織中存在MACC1 mRNA和蛋白質異常高表達,臨床分期越晚、組織分化越差、伴隨淋巴結轉移的癌組織中MACC1 mRNA和蛋白質表達越高,MACC1表達增加可能提示EOC患者預后不良,MACC1可作為晚期EOC預后監測的標志物[19-21]。本研究采用RT-PCR技術檢測正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤和EOC組織中miR-338-3p和MACC1基因的表達情況,結果顯示與正常卵巢組織和良性上皮性卵巢腫瘤相比,EOC組織中miR-338-3p表達明顯降低且MACC1基因表達明顯增高,提示二者異常表達可能參與卵巢癌的發生和發展。

miRNAs主要通過靶向調控下游相關基因的表達或信號通路的活性,進而參與各種生理和病理過程。在惡性腫瘤的發生發展過程中,多數miRNAs參與調控癌基因或抑癌基因,甚至同一個miRNA在不同的癌組織中表現出相反的調控作用[22]。研究表明,胃癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中存在miR-338-3p低表達和MACC1基因高表達,miR-338-3p可靶向調控MACC1基因,進而參與惡性腫瘤的侵襲和轉移[12-14]。本研究中,經miRNA調節靶基因在線開放數據庫檢索顯示,MACC1基因是miR-338-3p的下游調節靶基因之一。目前尚無卵巢癌組織中miR-338-3p靶向調控MACC1基因的相關報道。本研究進一步分析表明,不同性質卵巢組織中miR-338-3p和MACC1的表達呈明顯負相關,臨床分期越晚、組織級別越高、伴淋巴結轉移的EOC組織中miR-338-3p表達越低且MACC1表達越高,miR-338-3p低表達與EOC患者的復發和死亡相關,miR-338-3p低表達同時MACC1高表達患者的總體生存率和無進展生存率顯著降低。上述結果提示miR-338-3p低表達和MACC1高表達可能與EOC患者預后不良相關,結合既往相關報道推測可能是miR-338-3p靶向調控MACC1的表達,進而共同參與卵巢癌的進展和復發,二者有作為卵巢癌預后不良標志物的潛在價值。

綜上所述,本研究結果顯示EOC組織中存在miR-338-3p和MACC1異常表達,且與患者的預后不良相關,二者可能共同參與EOC進展和復發。在此基礎上進一步研究卵巢癌細胞中miR-338-3p靶向調控MACC1基因的分子機制,進一步闡明卵巢癌侵襲和轉移的分子機制,可為臨床探尋新的卵巢癌治療的分子靶點,從而為卵巢癌的精準治療提供新的方向。