亞洲人群中mircoRNAs與腦卒中發病關系的Meta分析*

楊錫彤，馬 蓉，徐弘揚，王光明△

(1.大理大學第一附屬醫院基因檢測中心,云南大理 671000;2.大理大學臨床醫學院,云南大理 671000)

腦卒中是一種突發性的腦血液循環障礙性疾病，全球每年大約有1 500萬新發病的腦卒中患者；腦卒中后患者生活不能自理，致殘率高達50%；因腦卒中而導致的病死率高達20%[1-2]。腦卒中是由多因素引起的復雜神經系統疾病，其中包括遺傳因素及環境因素，而流行病學的研究認為腦卒中的發生與遺傳因素有較大的關系[3]。

微小RNA(microRNA,miR)是一類內源性非編碼小分子RNAs，在真核細胞中主要是由19～25個核苷酸組成，通過與基因信使RNA(mRNA)3′非編碼端相結合，通過轉錄調控基因的表達，因此miR參與了包括細胞增殖、細胞發育、細胞分化、細胞凋亡和新陳代謝等一系列重要的生命進程[4-5]。單核苷酸基因多態性(SNP)是常見的遺傳變異之一，主要存在于前體miR(pre-miR)，可影響成熟miR的表達。當前的研究表明，SNP的位點存在于4種前體miR，包括miR-146aC>G(rs2910164),miR-149T>C(rs2292832),miR-196a2T>C(rs11614913)和miR-499A>G (rs3746444)[6-7]。這4種miR能影響血管損傷反應,miR-146a，miR-149，miR-196a2和miR-499等位基因分別與腫瘤調節因子-α(TNF-α)、四氫葉酸還原酶、膜聯蛋白1(ANXA1)、C反應蛋白(CRP)的調控有關[8-9],這些miRNA靶點與循環系統中的血栓或炎癥通路有關[10]。本研究擬通過對已發表的miR-146aC>G、miR-149T>C、miR-196a2T>C和miR-499A>G基因多態性與腦卒中的相關性研究進行Meta分析，以得出較為客觀的結論。

1 資料與方法

1.1檢索策略 電子檢索PubMed、Web of Science、CBM及知網、萬方、維普中文數據庫，檢索時間從建庫至2018年7月，獲取有關miR基因多態性和腦卒中的文章。為提高文獻的查全率和漏查率，分析過程中將進一步對入選研究的參考文獻進行擴大檢索，輔以文獻追溯法查找相關文獻，以提高Meta分析對文獻查全率的要求。英文檢索詞包括miR、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、polymorphism、SNP、stroke、ischemia、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction,中文檢索詞包括miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、微小RNA、基因多態性、腦卒中、腦缺血、腦血管疾病、腦出血、腦梗死。

1.2文獻納入與排除標準 (1)納入標準：①研究對象，評估miR-146a、miR-149、miR-196a2、miR-499基因多態性和腦卒中發病的相關性；②研究設計，文章為病例對照研究；③干預措施，病例組為腦卒中患者，對照組為健康人群；④足夠充分的數據可用于計算OR值；⑤對照組基因型分布符合H-W遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。(2)排除標準： ①重復研究、發表的文獻；②數據描述不清或樣本資料交代不清，統計方法不恰當；③腦卒中診斷不明確或沒有根據國際公認的標準；④綜述文獻；⑤非中、英文文獻。

1.3質量評估 對納入文獻的質量評價采Newcastle-Ottawa量表(NOS)評價，通過入選人群、組間可比性、暴露因素測量3個方面共8個條目對文獻質量進行評價，滿分為9分，6分及以上認為是高質量文獻[11-12]，評價項目包括(1)病例確定是否恰當，1分；(2)病例的代表性，1分；(3)對照組的選擇，1分；(4)對照組的確定，1分；(5)實驗設計和數據統計分析時考慮病例組和對照組的可比性，2分；(6)暴露因素的確定，1分； (7)病例組和對照組暴露因素的確定方法相同，1分；(8)無應答率，1分。

1.4數據提取 參考Cochrane協作網推薦的方法編制資料提取表,由2名研究者獨立篩選文獻、提取資料并進行交叉核對,如有不一致觀點通過討論進行解決。提取資料的主要內容為:(1)文獻的基本特征 (包括文題、年份、研究者姓名等)；(2)所納入文獻研究對象的基本特征、干預措施和結局指標。研究特征：研究地區和人群特征、研究組和對照組的例數和年齡特征；數據提取：研究組和對照組的各基因型的分布情況。

1.5統計學處理 采用Review Manager5.3軟件進行Meta分析，計數資料的效應指標選取比值比(OR)及其95%可信區間(CI)表示。異質性檢驗采用Q檢驗和I2統計量,如果異質性檢驗結果P≥0.05、I2<50%,表示各研究間無異質性,選用固定效應模型，計算合并比值并繪制森林圖；如果異質性檢驗結果P<0.05、I2>50%,表示研究間存在異質性,選用隨機效應模型。計算合并的OR和95%CI，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1納入的文獻基本特征 初步檢索出文獻146篇，按照文獻納入排除標準進行篩選，最終剩余11篇文獻(圖1)，文獻對照組都符合HWE，共計8 493例研究對象，其中病例組4 179例，對照組4 314例，納入研究的基本特征及對照組的HWE檢測見表1～4。

圖1 文獻篩選流程圖

表1 納入研究的miR-146a rs2910164的基本特征

a為研究對象的年齡段

表2 納入研究的miR-149 rs2292832的基本特征

表3 納入研究的miR-196a2 rs11614913的基本特征

a為研究對象的年齡段

表4 納入研究的miR-499 rs3746444的基本特征

2.2Meta分析的結果

2.2.1miR-146a rs2910164 對5種遺傳學模型(Gvs. C、GGvs. CC、GCvs. CC、GG+GCvs. CC、GGvs. GC+CC)進行Meta分析，結果表明攜帶G或GG基因的人群并未增加腦卒中的發生風險(P>0.05)，見表5。

2.2.2miR-149 rs2292832 對5種遺傳學模型(Cvs. T、CCvs. TT、CTvs. TT、CC+CTvs. TT、CCvs. CT+TT)進行Meta分析，結果表明miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中有相關性，人群中攜帶C或CC基因明顯增加了腦卒中的發生風險，見表6。

2.2.3miR-196a2 rs11614913 對5種遺傳學模型(Cvs. T,CCvs. TT,CTvs. TT,CC +CTvs. TT,CCvs. CT+TT)進行Meta分析，結果表明miR-196a2 rs11614913多態性與腦卒中的發生無相關性，見表7。

表5 miR-146a rs2910164 5種遺傳學模型森林圖結果統計

表6 miR-149 rs2292832 5種遺傳學模型森林圖結果統計

表7 miR-196a2 rs11614913 5種遺傳學模型森林圖結果統計

2.2.4miR-499 rs3746444 對5種遺傳學模型(Gvs. A,GGvs. AA,GAvs. AA,GG+GAvs. AA,GGvs. GA+AA)進行Meta分析，結果表明miR-499 rs3746444多態性與腦卒中的發生無相關性，見表8。

表8 miR-499 rs3746444 5種遺傳學模型森林圖結果統計

3 討 論

腦卒中的危險因素包括動脈粥樣硬化、高血壓、血脂異常和高同型半胱氨酸血癥，這些都屬于疾病因素，而目前多數臨床研究表明遺傳因素導致腦卒中發生的比例明顯增加[24]。miR在許多生理和病理過程中，包括腫瘤發生、增殖、造血作用、代謝、免疫功能、表觀遺傳學和神經退行性病變疾病，發揮著重要作用[25]。近年新的研究表明，循環miR可能是心血管疾病的新生物標記物，包括急性心肌梗死、心力衰竭、冠狀動脈疾病、糖尿病、腦卒中、原發性高血壓和急性肺栓塞[26]。近年來有關miR基因多態性與腦卒中易感性的研究越來越多，但因為人群和地區存在差異導致同一種族最后的研究結果不盡相同。因此，本研究通過對miR基因多態性與亞洲人群腦卒中易感性進行Meta分析，揭示miR基因多態性與腦卒中之間的相關性，明確遺傳因素對腦卒中診斷的意義。

4種miR多態性在前體miR中的序列，miR-146a C>G rs2910164位于5號染色體，159912418；miR-149 T>C rs2292832位于2號染色體，241395503；miR-196a2T>C rs11614913位于12號染色體，54385599；miR-499A>G rs3746444位于20號染色體，33578251[4-5]。這4種miR與血管損傷密切相關，miR-146、miR-149、miR-196a2和miR-499 分別調控TNF-α、四氫葉酸還原酶、ANXA1和CRP。TNF-α、四氫葉酸還原酶、ANXA1和CRP是導致腦卒中的一般原因。TNF-α與纖溶酶原激活物抑制劑1水平的升高有關，四氫葉酸還原酶功能障礙與血漿總同型半胱氨酸(tHcy)積累有關，ANXA1與TNF-α水平降低有關，CRP可以升高血壓，而在壓力條件下CRP和TNF-α能被同時激活[10]。這些研究表明，TNF-α、 ANXA1和 CRP之間有密切聯系。事實上，盡管存在數據的限制性，但仍然有miR多態性功能的研究。miR-146a G和miR-196a2 T與成熟miR水平降低有關。miR-149T>C和miR-499A>G均未見成熟miR表達，然而miR-499A與血漿CRP水平降低有關，由此可知，作者懷疑miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499 等位基因能夠通過抑制TNF-α 和 CRP水平在腦卒中的發病機制中起到保護性作用[27]。

本研究結果表明，miR-146a、miR-149、miR-196a2及miR-499僅有miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中易感性相關，等位基因C和CC基因型明顯增加腦卒中的患病風險。人群中攜帶CC基因型葉酸水平明顯低于TT基因型[22]，miR-149通過與四氫葉酸還原酶的mRNA-3′UTR結合調控四氫葉酸還原酶基因的表達[27]。四氫葉酸還原酶在甲硫酸-葉酸的編碼代謝中發揮著重要作用，人體內具有活性的miR-149-5p在四氫葉酸形成過程中起到促進作用[28]。miR-149 rs2292832位于miR-149前體非成熟結合區內，rs2292832能影響miR-149-5p表達，CC基因型人群中miR-149-5p的表達水平明顯高于CT基因型和TT基因型[29]。有研究表明，體內的四氫葉酸還原酶表達的降低能增加腦卒中發病率，而腦卒中患者的葉酸水平明顯比健康人群低，通過補充葉酸腦卒中的患病率得到明顯改善[8，10]。因此可認為miR-149 rs2292832 C等位基因和CC基因型通過影響成熟miR-149，調控miR-149與四氫葉酸還原酶基因的結合，降低四氫葉酸還原酶基因表達，抑制甲硫酸-葉酸代謝，降低體內5-甲基四氫葉酸的生成，從而增加腦卒中的發生風險。

本研究納入文獻僅限于中英文符合要求的文獻，研究人群為亞洲人群。亞洲人群miR基因多態性與腦卒中易感性相關性更合理、更可靠的結論依賴于開展大樣本、多中心、同質性的病例對照研究。本次研究存在一定的局限性，希望擴大樣本量和提高文獻質量來完善本次研究，最終也需要擴大地區差異以進一步驗證分析結果。

綜上所述，在miR中，miR-149 rs2292832基因多態性與腦卒中的發生有相關性，臨床醫生應對遺傳因素引起腦卒中的發生予以重視。