青葙皂苷對小鼠心肌梗死的保護作用及機制研究*

彭 暉，奚群英，徐長福，沈盛暉，馬彩艷，童 鴻

(浙江省立同德醫(yī)院心血管科，杭州 310012)

隨著經(jīng)濟水平的不斷提高和社會老齡化，心血管疾病的發(fā)病率不斷攀升，在心血管疾病中急性心肌梗死已成為引起人類死亡的第一大原因[1]。急性心肌梗死是在冠狀動脈狹窄的基礎(chǔ)上發(fā)生血管急性閉塞，導(dǎo)致心肌供血持續(xù)減少，產(chǎn)生心肌缺血和壞死，常并發(fā)惡性心律失常、室間隔穿孔、心臟破裂甚至猝死等一系列嚴重的心血管事件。雖然傳統(tǒng)的藥物治療、介入治療和外科搭橋手術(shù)等可以重建血運，挽救部分缺血區(qū)域的心肌，一定程度上改善心肌梗死患者的預(yù)后。即使患者在急性期未死亡，已壞死的心肌細胞無法再生，會逐漸被瘢痕組織代替，發(fā)生室壁變薄、心腔擴大、左心室重構(gòu)等一系列病理改變，導(dǎo)致心肌功能失代償，絕大多數(shù)患者最終發(fā)展成慢性心力衰竭[2]。因此，研究開發(fā)治療心肌梗死及改善心肌重構(gòu)的藥物臨床意義重大。青葙子(Celosiae Semen)來源于莧科青葙屬植物青葙(Celosia Argentea L.)的成熟種子，干燥后入藥。青葙子在許多經(jīng)典醫(yī)藥典籍和中國藥典中均有記載[3]，具有清肝明目的功效，主治視力模糊、肝火眩暈、眼生翳膜、肝熱目赤等癥狀。青葙皂苷(Celosins)是從青葙子中分離純化得到的五環(huán)三萜皂苷類化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、A、B、C、D、E、F和G 9種化合物，其中青葙皂苷Ⅰ、Ⅱ是其主要成分，發(fā)揮主要的藥理學(xué)作用[4]。最近研究表明，青葙皂苷可抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊巨噬來源泡沫細胞的形成及增加膽固醇流出，提示青葙皂苷在心血管疾病的防治中也具有積極作用[5]。青葙皂苷是否對心肌梗死具有心肌保護作用尚少有報道。本文通過建立小鼠急性心肌梗死模型探討青葙皂苷對急性心肌梗死的保護作用及其機制，為其進一步臨床開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體級 (SPF級) C57/B6雄性小鼠100只，8～10周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號為 SYXK(浙)2015-0009。實驗正式開始前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動物房溫度(25±1)℃，相對濕度(40±5)%，光照周期10～12 h，用標(biāo)準(zhǔn)小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。

1.1.2實驗藥物 青葙皂苷由本實驗室自制，方法如下：精密稱取青葙子藥材1 000 g，常規(guī)粉碎，40目過篩后置于2 L錐形瓶，加10倍量50%甲醇，浸泡12 h，超聲提取2次，每次30 min。合并提取液，減壓濃縮，干燥，得青葙皂苷7.2 g。經(jīng)高效液相色譜-蒸發(fā)光散色檢測，青葙皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量之和為81.2%。給小鼠灌胃時以5%西黃蓍膠(m/v)水溶配成混懸液，搖勻后使用。

1.1.3主要試劑 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)，冠狀動脈結(jié)扎線(寧波成和公司)，心肌肌鈣蛋白T(cT-nT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；白細胞介素(IL)-1β和IL-18檢測試劑盒(上海博湖生物科技發(fā)展有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(南京建成生物工程研究所)，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA 蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、隱熱蛋白(NLRP3)、凋亡相關(guān)點樣蛋白(ASC)和Caspase-1 p45羊抗鼠抗體(美國Abcam公司)，β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(IgG-HRP)和電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4主要儀器 小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，Vevo 2100 高分辨小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual sonics Inc公司)，快速組織細胞破碎儀(無錫沃信儀器有限公司)，Thermo CL31R型離心機和MK3 酶標(biāo)儀(美國 Thermo 公司)，電泳裝置和轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分組與給藥 100只C57/B6小鼠隨機分為5組(n=20)，分別為正常對照組、模型對照組、青葙皂苷小劑量(10 mg·kg-1·d-1)組、青葙皂苷中劑量(30 mg·kg-1·d-1)組和青葙皂苷大劑量(90 mg·kg-1·d-1)組[6]。青葙皂苷小劑量組、青葙皂苷中劑量組和青葙皂苷大劑量組分別灌胃給予10、30、90 mg·kg-1·d-1青葙皂苷，正常對照組和模型對照組C57/B6小鼠灌胃給予同體積的5%西黃蓍膠溶液。各組C57/B6小鼠造模前1周開始給藥，造模后繼續(xù)給藥4周。

1.2.2心肌梗死模型的建立 將80只C57/B6小鼠按體質(zhì)量用1%戊巴比妥鈉溶液經(jīng)腹腔麻醉，以小動物呼吸機輔助呼吸。胸部去毛，消毒。胸骨左緣縱行切開皮膚1.5 cm，逐層分離掀開胸大肌，左側(cè)第4、5肋骨打開胸腔暴露心臟。鈍性撕開心包在左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，可立即見結(jié)扎線以下心肌組織泛白發(fā)紺，確認心肌梗死模型建模成功后維持血管結(jié)扎，迅速將心臟送回胸腔，用雙手食指擠壓出胸腔內(nèi)的血液和氣體，然后依次縫合胸骨、肌層及皮膚。待小鼠恢復(fù)自主呼吸后送回鼠籠飼養(yǎng)。正常對照組C57/B6小鼠只穿線不結(jié)扎冠狀動脈左前降支，其余步驟均同心肌梗死組制備。

1.2.3心臟超聲檢測 各組C57/B6小鼠于造模4周時用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，取仰臥位，使用Vevo 2100檢測左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，由超聲心動圖電腦自動計算左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)，取連續(xù)6個心動周期的平均值。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附測定 各組C57/B6小鼠超聲檢查結(jié)束后眼眶取血1 mL，室溫下靜置30 min，4 ℃下離心(3 500 r/min離心5 min)， 分離得血清。按照IL-1β、IL-18、cT-nT、CK-MB和LDH試劑盒說明書操作，應(yīng)用雙抗體夾心法測定血清IL-1β、IL-18、cT-nT、CK-MB和LDH水平。

1.2.5心臟梗死面積測定 各組C57/B6小鼠采血后隨機取10只，尾靜脈注射1 mL伊文思藍(0.1 g/mL)，1 min后開胸迅速取出小鼠心臟，于-20 ℃儲存20 min，延縱軸切4～5個切片，每個切片1.0～1.5 mm。將每個切片用載玻片壓制成片，置于1% TTC染液于37 ℃下染色30 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定。梗死心臟區(qū)為白色，非梗死區(qū)為紅色。用數(shù)碼相機獲取圖像，并應(yīng)用Image J軟件計算梗死面積=梗死面積/(梗死面積+非梗死面積)×100%。

1.2.6Western blot檢測 各組剩余10只C57/B6小鼠脫頸椎處死后立即開胸取心臟，將血液擠干凈，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，切下大鼠左心室并切成米粒大小，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，進行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉(磷酸化抗體用4%牛血清清蛋白)封閉2 h，分別加入NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1 p45和β-actin一抗，4 ℃下孵育過夜。PBST溶液洗膜3次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜3次。加ECL液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠心功能指標(biāo)的比較 模型對照組小鼠LVESD和LVEDD均較正常對照組顯著升高(P<0.05)，LVEF和LVFS均較對照組顯著降低(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠LVESD和LVEDD，升高LVEF和LVFS，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與正常對照組比較;b：P<0.05，與模型對照組比較；c：P<0.05，與青葙皂苷低劑量組比較；d：P<0.05，與青葙皂苷中劑量組比較

圖1各組小鼠心肌梗死4周時心功能指標(biāo)的比較(n=20)

2.2各組小鼠血清心肌損傷標(biāo)記物水平的比較 模型對照組小鼠血清cT-nT、CK-MB和LDH水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠血清cT-nT、CK-MB和LDH水平，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2。

a：P<0.05，與正常對照組比較;b：P<0.05，與模型對照組比較；c：P<0.05，與青葙皂苷低劑量組比較；d：P<0.05，與青葙皂苷中劑量組比較

圖2各組小鼠心肌梗死4周時血清心肌損傷標(biāo)記物水平的比較(n=20)

2.3各組小鼠血清炎性指標(biāo)水平的比較 模型對照組小鼠血清IL-1β和IL-18水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)。青葙皂苷可降低心肌梗死小鼠血清IL-1β和IL-18水平，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與正常對照組比較;b：P<0.05，與模型對照組比較；c：P<0.05，與青葙皂苷低劑量組比較；d：P<0.05，與青葙皂苷中劑量組比較

圖3各組小鼠心肌梗死4周時血清炎性指標(biāo)的比較(n=20)

2.4各組小鼠心肌梗死面積的比較 正常對照組小鼠無心肌梗死區(qū)域(白色區(qū)域)，而模型對照組小鼠有梗死區(qū)域。青葙皂苷可抑制心肌梗死小鼠的心肌梗死面積，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05，與正常對照組比較;b：P<0.05，與模型對照組比較；c：P<0.05，與青葙皂苷低劑量組比較；d：P<0.05，與青葙皂苷中劑量組比較

圖4各組小鼠心肌梗死4周時心肌梗死面積的比較(n=10)

a：P<0.05，與正常對照組比較;b：P<0.05，與模型對照組比較；c：P<0.05，與青葙皂苷低劑量組比較；d：P<0.05，與青葙皂苷中劑量組比較

圖5各組小鼠心肌梗死4周時NF-κB-NLRP3信號通路相關(guān)蛋白水平的比較(n=10)

2.5各組小鼠心肌梗死4周時心肌NF-κB-NLRP3信號通路相關(guān)蛋白水平的比較 模型對照組小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)。青葙皂苷可抑制心肌梗死小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白表達，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖5。

3 討 論

心肌梗死是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡最主要的原因之一[6]。深入研究心肌缺血損傷的干預(yù)靶點和治療措施很有必要。現(xiàn)代植物化學(xué)研究顯示，青葙子的化學(xué)成分包括甾醇、有機酸、環(huán)肽和皂苷等化合物，其中青葙皂苷是其主要有效成分。體內(nèi)體外研究顯示富含青葙皂苷的提取物可顯著減輕高脂血癥、高血糖、氧化應(yīng)激和急性肝損傷，對非酒精性脂肪肝病也具有一定保護作用[7-9]。最近研究表明，青葙皂苷可抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊巨噬來源泡沫細胞的形成及增加膽固醇流出，提示青葙皂苷在心血管疾病的防治中也具有積極作用[5]。體內(nèi)研究顯示，青葙皂苷可通過增加自噬體數(shù)量、降低動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊相對面積，而發(fā)揮治療作用[10-11]。體外研究顯示，青葙皂苷可顯著降低巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬作用和泡沫細胞形成率，其作用可能與下調(diào)清道夫受體B3、A1 mRNA表達，上調(diào)三磷腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1、G1 mRNA表達以及自噬特異性蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3和beclin 1相關(guān)，從而促進了自噬過程。但是，青葙皂苷是否對心肌梗死具有心肌保護作用尚少有報道。本研究結(jié)果顯示，青葙皂苷可劑量依賴性降低心肌梗死小鼠的心肌梗死面積，降低心肌梗死小鼠LVESD和LVEDD、升高LVEF和LVFS，降低血清cT-nT、CK-MB和LDH水平，因此青葙皂苷可對心肌梗死具有保護作用，并且對心臟功能具有顯著的改善作用。

梗死后組織釋放各種趨化因子和細胞因子導(dǎo)致炎性細胞聚集，引起心肌組織纖維化和心臟重塑。早期重塑使心臟發(fā)生適應(yīng)性變化，長期處于這種狀態(tài)會導(dǎo)致心臟負荷增加，心功能下降，甚至發(fā)生心力衰竭[11-12]。調(diào)節(jié)梗死后的炎性應(yīng)答反應(yīng)可以改善心肌梗死后心臟重塑，增強心功能，降低病死率。炎性復(fù)合體是固有免疫和炎性反應(yīng)中的一類重要因子，可通過模式識別受體活化NLRP3/Caspase-1信號通路的蛋白復(fù)合體，在機體固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)中發(fā)揮重要平臺作用。NLRP3炎性小體是一種存在于細胞胞漿中的多蛋白復(fù)合物，是目前研究最多、也最為透徹的炎性小體[13]。多項研究表明，NLRP3炎性小體的激活或抑制可影響多種炎性及免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展，并且在急性心肌梗死時NLRP3炎性小體的形成和激活也顯著增加[14-16]。NLRP3炎性復(fù)合體主要由NLRP3、Caspase-1及ASC組成，激活NLRP3/ASC/Caspase-1主要分為兩個步驟：首先通過NF-κB參與信號通路介導(dǎo)NLRP3及proIL-1β、proIL-18的合成增加；第二步，NLRP3炎性小體進行組裝，催化合成IL-1β及IL-18并分泌至細胞外[17-18]。本研究結(jié)果顯示，青葙皂苷可呈劑量依賴性抑制心肌梗死小鼠心肌NF-κB p65、NLRP3、ASC和Caspase-1 p45蛋白表達，而促進IκB α蛋白表達，因此青葙皂苷對NLRP3/Caspase-1信號通路激活的第一步驟具有顯著抑制作用。此外，青葙皂苷可呈劑量依賴性降低心肌梗死小鼠血清IL-1β及IL-18水平，說明青葙皂苷對NLRP3/Caspase-1信號通路激活的第二步驟具有顯著抑制作用。因此，青葙皂苷對心肌梗死的保護作用可能與其調(diào)控NLRP3/ASC/Caspase-1信號通路有關(guān)。

總之，青葙皂苷對心肌梗死具有保護作用，其作用可能與其調(diào)控NLRP3/ASC/Caspase-1信號通路有關(guān)。