大腸桿菌胞內代謝物組學分析樣品前處理條件優化

李陽 王繼彤 劉曉露 田靜 賈錚 肖志明 樊霞

摘 要 ：建立了適用于大腸桿菌胞內代謝物組學分析的樣品前處理條件。大腸桿菌菌體細胞采用冷凍鹽水（0.85% NaCl，80℃預冷15 min）進行猝滅，猝滅后的菌體細胞經過真空冷凍干燥，再通過液氮冷凍研磨結合超聲裂解的方式通透細胞膜，最后采用冷甲醇水（MeOHH2O，1∶1，V/V，4℃）提取胞內代謝物。分別采用流式細胞術檢測和OD值回收率從單細胞水平和整體水平評價猝滅溶劑對大腸桿菌細胞膜損傷影響。結果表明，采用冷凍鹽水猝滅大腸桿菌細胞損傷率小于5%。采用液相色譜飛行時間質譜（T3和Hilic 2種色譜分離結合ESI±掃描模式）檢測結果中低碰撞能量提取出的峰數量和總離子強度評價了3種細胞通透方式和4種提取溶劑組合的胞內代謝物提取效果。結果表明，冷凍研磨結合超聲裂解通透細胞膜、冷甲醇水提取代謝物測得的代謝物數量最多（≥105），并且總離子強度在最優范圍（106～107）內。本研究采用冷凍干燥、冷凍研磨和超聲萃取相結合的代謝物提取方式，有效促進了細胞膜裂解，提高了代謝物提取效率。本研究建立的前處理條件適用于大腸桿菌胞內代謝物組學分析。

關鍵詞 ：大腸桿菌; 胞內代謝物; 組學分析; 樣品前處理

1 引 言

隨著分離、分析技術和計算機信息學的不斷發展，代謝組學技術日趨成熟和進步，已被應用到多個領域。由于微生物在生物體系中具有重要地位，開展微生物代謝組學研究受到廣泛關注，并形成具有獨特性和系統性的研究策略[～3]。利用代謝組學技術對微生物細胞內所有低分子質量的代謝物（包括代謝中間產物、激素、信號分子和次生代謝產物）同時進行定性和定量分析，獲得高通量代謝物結果信息，再利用化學計量學建模和預測，進而了解相關代謝途徑調控和變化的關鍵信息，為深入了解微生物代謝調控提供了更直接的技術手段[4，5]。微生物代謝組學實驗主要內容是樣品前處理、數據采集、數據分析和生物學活性和功能分析歸屬，其中樣品前處理是實驗的第一步，也是關鍵的一步[6]。微生物代謝組學樣品前處理包括受試菌的復蘇和培養、菌體細胞猝滅、細胞膜通透以及代謝物提取[7]等。由于不同受試微生物生物活性和生理結構不完全相同，所采用的前處理條件各異。目前尚無通用的標準方法能夠適用于所有微生物樣品前處理。菌體細胞猝滅是樣品前處理過程中至關重要的實驗步驟，已報道的猝滅方式包括有機試劑法[8]、極端pH法[9]、快速過濾法[0]和冷溶劑猝滅法[1]。其中高濃度有機試劑或極端pH條件容易造成微生物細胞膜破裂，進而導致胞內代謝物泄漏。快速過濾方式操作不便，如果濾紙孔徑太大會影響菌體收集數量，濾紙孔徑過小導致濾膜堵塞，過濾時間延長。冷溶劑猝滅是溫和、高效的猝滅方式，能夠瞬間抑制細胞內代謝酶活性，將細胞代謝“凍結”在某一時間點[2]。需要注意的是， 使用低溫溶劑同樣需要考慮菌體細胞膜破裂導致胞內代謝物泄漏。細胞通透的目的是將細胞膜打開，使代謝物全部釋放，以便于后續提取。目前，應用較多的通透方式為反復凍溶和超聲處理[3，14]。代謝產物提取則應根據關注的代謝物溶解特性選擇最適提取試劑，最大限度將代謝物提取出來。同時，選擇提取溶劑時還應考慮代謝物穩定性、提取溶劑是否容易去除， 以及提取溶劑與儀器分析系統的兼容性。

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）遺傳背景清楚且培養條件簡單，是各種生物化學、生物技術研究的重要模式生物[5]。開展E. coli代謝組學研究可為更深入地闡明E. coli代謝調控機理提供新的解決途徑。本研究采用流式細胞術檢測[5]和OD值回收率[6]評價了不同低溫猝滅溶劑對E. coli細胞損傷的影響，利用飛行時間質譜檢測結果中低碰撞能量下的出峰數量和總離子強度評價了不同細胞通透方式和提取溶劑組合的代謝物提取效果。通過比較優化，確定了適用于E. coli胞內代謝物組學分析的細胞猝滅溶劑和代謝物提取溶劑，提出了猝滅細胞冷凍干燥后冷凍研磨結合超聲萃取的代謝物提取方式，在細胞猝滅過程中最大程度避免細胞膜損傷，提取過程中有效促進細胞壁破裂，提高了胞內代謝物提取效率， 此條件能夠滿足E. coli代謝組學分析要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

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