過表達miR-26b-5p抑制HMGA1參與卵巢癌細胞上皮間質轉化的機制

曹文紅

卵巢癌是婦科惡性腫瘤之一，發病率位居婦科惡性腫瘤第三位，死亡率位居第一位。其惡性程度高、侵襲轉移能力強，極大影響女性生存質量[1]。鑒于其生理學特性，卵巢位于盆腔深部，早期缺乏特異性癥狀，且缺乏有效篩查途徑，多數患者確診時已是晚期。卵巢癌治療效果差，生存率低，化療易產生耐藥性和復發，所以對卵巢癌的治療是臨床研究的一個重要問題。近年來，有研究數據提示，上皮間質轉化在卵巢癌侵襲轉移進程中起關鍵作用[2]，發現miRNA參與多種生物過程，并與人類眾多癌癥息息相關[3]。miRNA在卵巢癌中具有特異性表達的特征，可作為腫瘤的標志物；且miRNA通過介導靶基因表達在實體腫瘤中發揮重要作用。上皮間質轉化相關標志物E-cadherin和Vimentin的表達可提示腫瘤的進展[4，5]。本研究主要對miR-26b-5p介導HMGA1基因參與卵巢癌上皮間質轉化的機制進行研究，為卵巢癌上皮間質轉化提供分子學作用機制，促進卵巢癌分子靶向治療。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 卵巢癌細胞系購于中國科學院上海生命科學研究所；Western blot抗體購于Abcam(Cambridge，UK)；反轉錄試劑盒(Fermentas公司，USA)；BCA試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 組織樣本收集 收集我院病理科40例卵巢癌患者卵巢上皮組織及40例健康人正常卵巢上皮組織。采用HE染色確認標本組織類型。本研究經我院醫學倫理委員會批準審核并獲組織提供者同意。

1.3 方法

1.3.1 miR-26b-5p靶基因預測 利用disgenet數據庫對卵巢癌靶基因進行預測；利用miRDB對靶基因miR進行預測。

1.3.2 卵巢上皮細胞原代培養和卵巢癌細胞培養 以原代培養的正常卵巢上皮細胞作為內參。正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系SKOV3均置于常規CO2培養箱內培養。待細胞生長匯合到80%時常規胰酶消化、傳代，采用對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3.3 qRT-PCR 按照Trizol法提取組織和細胞RNA。取5 μl RNA樣品稀釋，并測定RNA的濃度和純度。參照標準PCR檢測程序，應用ABI7500定量PCR儀進行qRT-PCR實驗。每對引物設3個復孔。以GAPDH為內參。

1.3.4 細胞分組轉染 卵巢癌細胞分別進行分組轉染，卵巢癌細胞分別改變miR-26b-5p表達(miR-26b-5p mimic)、HMGA1表達(sh-HMGA1)以及共轉染實驗(miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1)。初步檢測確定miR-26b-5p和MGA1表達后，對細胞進行分組：(1)為探究miR-26b-5p對卵巢癌細胞上皮間質轉化的影響，分為miR-26b-5p mimic內參(negative control)組和miR-26b-5p mimic組；(2)為研究HMGA1是miR-26b-5p的功能性靶基因，細胞實驗構建組別包括：mimic NC組、miR-26b-5p mimic組、inhibitor NC組、miR-26b-5p inhibitor組；(3)為研究MGA1調控卵巢癌細胞上皮間質轉化，將細胞實驗構建組別為：sh-HMGA1內參組和sh-HMGA1組；(4)為探究miR-26b-5p靶向HMGA1對卵巢癌細胞上皮間質轉化的影響，將進一步構建miR-26b-5p inhibitor內參組及miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組。

1.3.5 Western blot實驗 RIPA裂解提取待測組織和細胞的總蛋白。使用BCA法測蛋白濃度；上樣、電泳、蛋白分離并轉膜，隨后封閉。加入一抗兔多克隆抗體：HMGA1、E-cadherin、Vimentin和GAPDH；處理后加入加辣根酶標記羊抗兔IgG，室溫孵育。TBST洗膜后加入ECL化學發光液進行曝光，圖片掃描，應用ImageJ分析軟件處理實驗數據。

1.3.6 劃痕實驗和Transwell侵襲實驗 (1)取合適細胞接種至6孔板，移液槍小心劃線，并測量細胞遷移距離并記錄；(2)在Transwell上室中加入稀釋Matrigel，37 ℃孵育；(3)消化、計數細胞，調整細胞密度，加入Transwell小室。所有步驟均按劃痕和侵襲實驗常規操作。

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測miR-26b-5p和HMGA1表達 HE染色證實標本組織分別為卵巢癌組織和正常卵巢上皮組織，如圖1所示。采用qRT-PCR檢測卵巢組織中miR-26b-5p和HMGA1的表達。結果提示：與正常卵巢上皮組織相比，miR-26b-5p在卵巢癌組織中低表達(7.18±0.66vs4.33±0.28)，HMGA1在卵巢癌組織中高表達(0.92±0.15vs2.71±0.40；P<0.05)。

進一步檢測正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系SKOV3中miR-26b-5p和HMGA1的表達。結果提示：與正常卵巢上皮組織相比，卵巢癌細胞SKOV3中miR-26b-5p為低表達(0.85±0.21vs0.33±0.10)；HMGA1在癌細胞中高表達(0.46±0.20vs1.44±0.37；P<0.05)。

圖1 卵巢組織病理圖片(HE，×100)

2.2 miR-26b-5p靶向抑制HMGA1表達 qRT-PCR結果提示：分別與mimic NC組和inhibitor NC組相比，miR-26b-5p在miR-26b-5p mimic組和miR-26b-5p inhibitor組分別呈顯著上調和顯著下調趨勢，而HMGA1的mRNA和蛋白表達分別呈顯著下調和顯著上調趨勢(均P<0.05，表1)，而mimic NC組和inhibitor NC組差異無統計學意義。

表1 qRT-PCR和Western blot檢測轉染后卵巢癌細胞中miR-26b-5p和HMGA1的表達

注：與mimic NC組比較，①P<0.05；與inhibitor NC組比較，②P<0.05

2.3 細胞轉染對卵巢癌細胞上皮間質轉化的影響 qRT-PCR和Western blot檢測不同細胞轉染處理對E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達的影響(表2)。結果提示：與miR-26b-5p mimic內參組相比，miR-26b-5p mimic組E-cadherin的mRNA和蛋白表達均呈顯著上調趨勢，Vimentin的mRNA和蛋白表達均呈顯著下調趨勢(均P<0.05)。且與sh-HMGA1內參組相比，sh-HMGA1組E-cadherin的mRNA和蛋白表達均顯著升高，而Vimentin的mRNA和蛋白表達均顯著降低(均P<0.05)。

而與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組E-cadherin的mRNA和蛋白表達均顯著降低，而Vimentin的mRNA和蛋白表達均顯著增加(均P<0.05，表2)。

表2 qRT-PCR和Western blot檢測細胞轉染后卵巢癌細胞中上皮間質轉化相關蛋白的表達

注：與miR-26b-5p mimic內參組相比，①P<0.05；與sh-HMGA1內參組比較，②P<0.05；與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，③P<0.05

2.4 細胞轉染對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響 與miR-26b-5p mimic內參組相比，miR-26b-5p mimic組癌細胞侵襲和遷移均呈顯著降低趨勢(均P<0.05)。同時，與sh-HMGA1內參組相比，sh-HMGA1組癌細胞侵襲和遷移均顯著降低(均P<0.05，表3)。與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組癌細胞侵襲和遷移均顯著增加(均P<0.05)。

表3 細胞侵襲和劃痕實驗檢測細胞轉染后卵巢癌細胞侵襲遷移變化

注：與miR-26b-5p mimic內參組相比，①P<0.05；與sh-HMGA1內參組比較，②P<0.05；與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，③P<0.05

3 討 論

本研究作為一項分子機制研究，關注miRNA轉錄后調控靶基因表達的小分子RNA在卵巢癌中的潛在功能。通過采集卵巢癌患者的癌組織及體檢人群正常卵巢上皮組織，檢測miR-26b-5p和HMGA1的表達情況，并通過細胞系實驗進一步驗證表達趨勢。基于此，本研究進一步通過質粒轉染，在細胞系試驗中通過不同研究目的和質粒轉染構建組別，逐一研究miR-26b-5p和HMGA1分別與上皮間質轉化的關聯，并在前述研究結果基礎上，進一步確認miR-26b-5p靶向調控HMGA1表達進而調控上皮間質轉化。

本研究納入40例卵巢癌組織及40例正常卵巢上皮組織，檢測發現miR-26b-5p在卵巢癌組織中低表達，HMGA1在卵巢癌組織中高表達，卵巢癌細胞系SKOV3趨勢一致，為后續質粒構建奠定基礎。與此同時，為驗證生物數據庫靶基因預測結果，本研究通過qRT-PCR和Western blot檢測進一步驗證HMGA1是miR-26b-5p的功能性靶基因。miR-26b-5p在miR-26b-5p mimic組和miR-26b-5p inhibitor組分別呈顯著上調和顯著下調趨勢，而HMGA1分別呈顯著下調和顯著上調趨勢，表明miR-26b-5p能夠靶向抑制HMGA1表達。進而，qRT-PCR和Western blot檢測miR-26b-5p mimic轉染和sh-HMGA1轉染后卵巢癌細胞上皮間質轉化相關蛋白表達，發現分別上調和抑制miR-26b-5p和HMGA1的表達，E-cadherin的mRNA和蛋白表達均顯著升高，Vimentin表達顯著降低。此結果提示，miR-26b-5p高表達和沉默HMGA1表達能夠抑制上皮間質轉化，并抑制細胞侵襲和遷移。

本研究結果基本驗證，miR-26b-5p和HMGA1表達的調控可影響卵巢癌上皮間質轉化的假設。實驗關鍵在于進一步確認miR-26b-5p是否可靶向調控HMGA1表達，進而調控上皮間質轉化。因此，本實驗進一步構建miR-26b-5p inhibitor內參組及miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組，通過qRT-PCR和Western blot檢測E-cadherin和Vimentin表達。結果提示：下調miR-26b-5p表達(即miR-26b-5p inhibitor)能夠促進癌細胞上皮間質轉化，同時提高細胞侵襲和遷移能力，而共轉染miR-26b-5p inhibitor和sh-HMGA1后，下調HMGA1表達對上皮間質轉化的抑制作用得到逆轉，因此推測下調miR-26b-5p表達能夠通過靶向作用促進HMGA1的表達，進而促進上皮間質轉化，同時促進卵巢癌細胞的侵襲和遷移。

本研究結果發現，上調miR-26b的表達，可在卵巢癌細胞發揮抑制增殖并誘導凋亡的作用；而HMGA1表達顯著上升[6-8]，那么抑制其表達，同樣可發揮抑癌作用。本文機制探索為腫瘤靶向治療提供新視角，例如，既往有研究報道，miR-26b-5p模擬物轉染肺癌A549細胞可抑制增殖和誘導凋亡，而用miR-26b-5p抑制劑轉染槐耳(草本天然菌)處理A549細胞可逆轉槐耳抗腫瘤作用，提示可通過探索腫瘤分子機制通路，采用特定藥物進行腫瘤靶向治療[9]。眾所周知，上皮間質轉化是引發腫瘤細胞增殖侵襲的重要進程[10]，可導致細胞極性的喪失，從而促進細胞遷移侵襲和抗凋亡能力。通過本文實驗設計，基本可推測miR-26b-5p靶向調控HMGA1表達調控卵巢癌上皮間質轉化的作用機制：上調miR-26b-5p表達和沉默HMGA1基因表達，進而促進上皮間質轉化標志物E-cadherin的表達且抑制Vimentin表達，進一步抑制細胞侵襲和遷移[11]。本研究結果提示，miR-26b-5p具有逆轉卵巢癌細胞上皮間質轉化的能力，進一步降低細胞侵襲和遷移能力。與此同時，基于本研究探索可知，miRNA與靶基因關聯復雜多樣，單個miRNA可靶向多個靶基因且單個靶基因亦可受多個miRNA調控[12]；此種復雜的靶向和調控關系，提示卵巢癌上皮間質轉化還存在其他機制性靶點[13，14]，從而影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為，可為卵巢癌及其他腫瘤的分子靶向治療提供幫助。

綜上所述，miR-26b-5p在卵巢癌中低表達，HMGA1高表達；過表達miR-26b-5p抑制卵巢癌細胞中HMGA1和Vimentin表達并促進E-cadherin表達，降低細胞侵襲和遷移，從而抑制卵巢癌細胞上皮間質轉化，但其意義是否顯著還有待進一步探究。