圍產期孕婦感染B族鏈球菌耐藥性及相關耐藥基因檢測

【摘 要】目的：調查孕晚期婦女感染B族鏈球菌（GBS）耐藥性以及相關大環內酯類耐藥基因的表達情況。方法：K-B紙片擴散法檢測GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性，再以D試驗檢測克林霉素誘導耐藥表型。紅霉素和克林霉素耐藥基因用PCR方法檢測。結果：未發現萬古霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢克肟耐藥菌株，紅霉素、克林霉素、四環素、氯霉素的耐藥率依次為74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。青霉素有1例中介、1例耐藥。ermB基因為主要的紅霉素耐藥基因，占51.61%。兩種erm基因同時陽性占16.13%，有1株含erm B基因，但對紅霉素敏感。所有的紅霉素耐藥菌株中未檢出ermA、ermC基因。結論：青霉素仍可作為預防和治療GBS感染的首選藥物，紅霉素和克林霉素作為替代藥物表現出較高的耐藥性和交叉耐藥。ermB編碼的核糖體修飾是導致大環內酯類耐藥的主要機制。因此臨床醫生針對青霉素過敏，大環內酯類耐藥的患者應及時根據藥敏合理選擇抗生素，避免重復選擇大環內酯-林可霉素-鏈陽霉素B（MLSB）類抗菌藥物，減少耐藥菌株的產生。

【關鍵詞】B族鏈球菌;耐藥性;耐藥基因

B群鏈球菌（group B streptococci，GBS），又稱無乳鏈球菌，是新生兒肺炎、腦膜炎、菌血癥的主要病原菌，圍產期孕婦感染可導致早產、胎膜早破、晚期流產等不良妊娠結局[1，2]。目前治療GBS感染主要使用β-內酰胺類和大環內酯類藥物，隨著大環內酯類抗生素的使用顯著增加，我國GBS對大環內酯類抗菌藥物尤其是紅霉素的耐藥問題也日趨嚴重，本研究旨在了解本地區GBS耐藥性及相關大環內酯類耐藥基因的表達，為臨床治療GBS提供指導，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：采集2016年9月至2017年2月于我院就診的35-37周妊娠晚期孕婦宮頸和直腸捻拭子，所有標本經細菌培養、CAMP試驗、促酶試驗鑒定后共收集GBS陽性菌株31株。

1.2 藥敏試驗

參照2013年美國臨床及實驗室標準協會（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）說明，采用K-B紙片擴散法測定GBS菌株對常用抗菌藥物的敏感性;D試驗法方法檢測克林霉素誘導（MLSB）耐藥表型。M-H瓊脂及抗菌藥物紙片購自南京茂捷微生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌AT25923為質控菌株。

1.3 耐藥基因檢測

以PCR法檢測耐藥基因ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA、linB。PCR反應總體系為20μL，包括10×PCR Mix 10μL，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用ddH2O補足至20μl。引物由上海生工生物工程有限公司合成，Taq PCR MasterMix（含染料）、qPCR反應液和DNA標記物DL2000均購自Biomed公司產品。具體引物序列及PCR反應條件。

1.4 統計學分析

采用世界衛生組織細菌耐藥性監測網提供WHONET5軟件進行分析。

2 結果

2.1 藥敏結果

紅霉素、克林霉素、四環素、氯霉素的耐藥率依次為74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。萬古霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢克肟100%敏感，青霉素有1例中介、1例耐藥。

2.2 D實驗結果

cMLS表型為主要耐藥表型，占54.84%（17/31），檢出M型6株，L型1株，未檢出iMLS表型。

2.3 耐藥基因結果

紅霉素耐藥基因以erm基因為主，其中ermB15株，ermTR基因6株。同時表達ermB和ermTR基因的有5株，同時表達ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB基因有4株。所有標本均未檢出ermA及ermC基因。克林霉素誘導耐藥表型與大環內酯類耐藥基因陽性的關系。

3 討論

GBS又稱無乳鏈球菌，是定植于患者胃腸道及泌尿生殖道常見的條件致病菌，圍產期感染可導致多種不良母嬰后果，因此篩查GBS帶菌率，降低圍產期GBS感染發生率和危害成為世界各國都重視的問題。我國在《孕前和孕期保健指南（第一版）》中也已明確將妊娠35～37周GBS篩查作為備查項目。

美國疾病控制中心（CDC）最新指南提出青霉素為治療和預防GBS的首選藥物，如對青霉素過敏，可選擇頭孢類抗生素，或選擇紅霉素或克林霉素替代[3]。目前紅霉素和克林霉素耐藥呈全球分布，而且有不斷升高趨勢。韓國在1995-2013年期間收集在三個不同區域的醫院所獲得的新生兒GBS分離株，所有菌株對青霉素敏感紅霉素和克林霉素耐藥率分別為51.8%和55.4%。相關文獻調查發現深圳地區GBS對紅霉素、克林霉素的耐藥率分別為69.71%、64.86%，且2012-2015年耐藥率逐年上升。本實驗中紅霉素、克林霉素耐藥率分別為74.19%、58.06%，與國內多位學者的研究相近，明顯高于南非、伊朗的研究數據。不同國家及地區的大環內酯類抗菌藥物的耐藥率存在差異可能與地區及人種差異有關。產前及產時預防性使用抗生素增加了大環內酯類抗菌藥物耐藥率，對青霉素過敏患者臨床應根據藥物試驗結果及時調整用藥方案，減少菌株耐藥性的產生。本實驗青霉素多數對GBS敏感，但有1例中介、1例耐藥。日本和香港也有類似報道，說明青霉素仍可作為治療GBS的首選藥物，但其敏感度降低的趨勢需要引起重視和關注。

GBS對大環內酯類耐藥的機制主要有兩方面，一是由mef基因編碼的特異大環內酯類外排機制增強;二是erm基因通過編碼的核糖體甲基化酶使23S r RNA甲基化，使大環內酯類抗菌藥物靶位發生變化，導致大環內酯-林可霉素-鏈陽霉素B類抗菌藥物（MLSB）與細菌核糖體靶位的結合力下降，產生結構性或誘導性耐藥。本研究發現對紅霉素耐藥的GBS菌株主要耐藥表型為cMLS表型，耐藥基因為ermB（69.56%）。有16.12%的菌株同時檢出了ermB和ermTR兩種基因。同時表達ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB三種基因的有4株。相關文獻研究認為紅霉耐藥性主要與基因ermB、ermB-mefA（E）有關。最主要的表型為CMLS，占77.8%。有關文獻從2008年到2013年收集了40例GBS分離株。在紅霉素耐藥菌株中73.0%僅攜帶ermB基因，5.4%攜帶mefA基因，21.6%表達ermB和mefA基因。此外38%的分離株檢測到ermB和linB基因，mefA基因介導的外排泵也分布。多項研究提示GBS耐藥是ermB介導核糖體靶位改變能起主導，多種耐藥機制共同作用的過程。本研究有1株GBS不含上述紅霉素耐藥基因的任何一種基因，但仍對紅霉素耐藥，說明可能還有其他的機制尚未發現。

綜上所述，青霉素類和頭孢菌素類藥物對GBS敏感性高，仍為首選推薦方案，大環內酯類抗菌藥物作為備選藥物耐藥率逐年上升，同時檢出的耐藥基因種類增多。ermB編碼的核糖體修飾是導致大環內酯類耐藥的主要機制，臨床醫生在抗生素選擇時應根據藥敏結果合理選擇，避免重復選擇MLSB類抗菌藥物，減少耐藥菌株的產生。

參考文獻

[1]應群華，嚴文衛，丁金龍.圍產期生殖道菌群檢測和B群鏈球菌篩查[J].中國微生態雜志，2006，18（6）：491-492.

[2]朱敏，范建霞，程利南.圍產期B群鏈球菌研究進展[J].中華婦產科雜志，2005，40（2）：137-141.

[3]Verani JR， McGee L， Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease–revised guidelines from CDC， 2010. MMWR Recomm Rep 2010，59：1-36.

作者簡介

鄒霞，女，四川省瀘州市人。研究生。檢驗師。研究方向為分子診斷。