慢病毒攜帶增強型綠色熒光蛋白基因標記大鼠脂肪干細胞及體內示蹤研究

張瑤瑤 吳國民 張瀟毅 王 琳 肖艷菊 王祥伸 陳 楷

自2001年Zuk[1～3]首次在成體脂肪組織中分離培養出具有多向分化潛能的間充質干細胞以來，脂肪組織來源的間充質干細胞成為研究熱點。脂肪干細胞取材方便、來源廣泛，成為組織工程研究中較為理想的種子細胞[4]。在組織缺損修復研究中，脂肪干細胞廣為應用，但脂肪干細胞在組織內的存活、遷移、分布、轉歸及生物學作用的發揮尚不清楚。因此，脂肪干細胞的示蹤性研究逐漸成為干細胞研究的重點，找到一種穩定且不影響脂肪干細胞生物學特性的標記方法是本文研究的主要內容。

資料和方法

1.實驗動物、試劑及儀器：健康雄性SD 大鼠，清潔級，體質量120～140g，實驗動物許可證號：scXK-遼 -2015～0001。DMEM 培養液（Hyclone）、Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、雙抗、PBS、胎牛血清（BI）、病毒感染劑、攜帶EGFP 的慢病毒（上海吉凱基因有限公司）。地塞米松、吲哚美辛、IBMX、胰島素、β-甘油磷酸、抗壞血酸、維甲酸（Sigma），轉化生長因子βl（TGF-βl）（Peprotech），油紅O 染色液、阿爾新藍染色液（索萊寶生物試劑公司）、ALP 顯色試劑盒、cck8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），CD90、CD34單抗，FITC標記抗體，EGFP一抗（Invitrogen），二抗試劑盒，DAB 顯色試劑盒（中杉金橋）。生物安全柜（Thermo Scientific），熒光顯微鏡（Nikon，Japan），流式細胞儀（BD，USA）。

2.ADSCs 的分離和培養：大鼠脫頸處死，無菌條件下取腹股溝脂肪，剔除血管和筋膜。將脂肪組織剪碎，0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化1h，每10min震蕩一次。1500r/min 離心5min，棄上清，重懸，移入培養瓶內，于37℃，5% CO2飽和濕度條件下培養。24h 后首次換液，細胞生長至75%～90%融合時傳代，每3d 更換培養液。

3.ADSCs 表面標志物檢測：取第 3 代 ADSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS 沖洗3 遍，100μL PBS重懸，分別加入CD90、CD34 單抗，4℃孵育30min，PBS 漂洗，加入 FITC 標記抗體，4℃避光孵育30min，1000r/min 離心 5min，PBS 漂洗。流式細胞儀檢測細胞表面標記物的表達。

4.ADSCs 成骨、成脂、成軟骨誘導：ADSCs 以 105個/孔接種于6 孔板中。24h 細胞貼壁后，換為成骨誘導液（DMEM、10%FBS、1%雙抗、抗壞血酸50ug/ml、β-甘油磷酸鈉10mM、地塞米松100nM）、成脂誘導液（DMEM、10%FBS、1%雙抗、地塞米松1uM、吲哚美100uM、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）500uM、胰島素辛 10ug/ml）、成軟骨誘導液（DMEM、10%FBS、1%雙抗、地塞米松 1uM、抗壞血酸50ug/ml、維甲酸 10-4uM、TGF-B110ug/L）誘導 14 天行堿性磷酸酶染色，21 天行油紅O 染色，14 天行阿爾新藍染色。

5.攜帶EGFP 基因的慢病毒轉染ADSCs：取P3代脂肪干細胞以105/孔鋪于6 孔板內，將EGFP 重組慢病毒顆粒按照 MOI＝0、1、10、25、50、100 加入孔板內，每孔加入40ul 病毒感染試劑并用培養液定容至 1ml，MOI＝0 為空白對照。感染 16h 后，PBS 洗3 次，加入完全培養液，每3d 更換培養液。

6.流式細胞儀分析陽性轉染率：各轉染組用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS 清洗離心2 次，重懸，200 目細胞篩過濾，調整細胞濃度為5×105/ml，取200ul 細胞懸液放入流式管內，測EGFP的表達率。

7.EGFP-ADSCs 增殖能力檢測：以2000/孔的密度將細胞接種于孔內，每孔加入100ul 培養液，培養箱中培養。于 1、2、3、4、5、6、7 天測 OD 值。每孔加入10ul cck8 試劑，培養箱中培養 1h，450nm 酶標儀測吸光度值（A 值），繪制生長曲線。

8.EGFP-ADSCs 成骨、成脂、成軟骨誘導：GFPADSCs 以 105個 /孔接種于 6 孔板中。24h 細胞貼壁后，換為成骨、成脂、成軟骨誘導液，分別于14 天、21天、14 天行堿性磷酸酶、油紅O、阿爾新藍染色。

9.將標記細胞移植到大鼠體內：30 只SD 大鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組15 只。0.25%胰蛋白酶消化EGFP-ADSCs，調整細胞懸液濃度為5×108/ml，將20ul 細胞懸液注入實驗組大鼠皮下。對照組注射相同劑量的生理鹽水。移植后1w，2w，4w 隨機取實驗組、對照組各5 只大鼠，取注射部位組織行冰凍切片熒光觀察及EGFP 免疫組化染色。

結 果

1.ADSCs 分離培養及細胞形態觀察：原代培養24h 見少量細胞貼壁，細胞呈多角形，大小不一。傳代后細胞生長速度明顯加快，2～3d 即可融合80%，細胞體積增大，長梭形，生長具有方向性（圖1）。

圖1 A：P0 代脂肪干細胞；B：P3 代脂肪干細胞（× 10）

2.ADSCs 表面標志物檢測結果：流式細胞術結果可見，ADSCs 表面標志顯示CD90 呈陽性，CD34呈陰性（圖2）。

3.ADSCs 成骨、成脂、成軟骨多向誘導：成骨誘導2 周，細胞形態由長梭形變成多角形，堿性磷酸酶染色結果為陽性。成脂誘導21 天，細胞呈圓形，油紅O 染色可見大量紅染脂滴。成軟骨誘導14 天，細胞形態不規則，大小不一。阿爾新藍染色陽性，細胞和周圍的基質染成藍色（圖3）。

圖2 CD90 陽性表達，CD34 陰性表達

圖3 ADSCs A1 堿性磷酸酶染色陽性（ ×10），B1 油紅o 染色陽性，C1 阿爾辛藍染色陽性（ ×40）

4.EGFP 轉染率分析：EGFP 轉染 96h 后可見明顯綠色熒光。ADSCs 表達熒光的數量和強度與MOI呈正相關（圖4）。經流式細胞儀檢測，MOI 為 0、1、5、10、25、50 的轉染效率為 0.12%、3.62%、42.4%、66.6%、90.4%、98.0%（圖5）。

圖4 EGFP 熒光表達

圖5 流式細胞儀測轉染組的轉染率：MOI 為 0、1、5、10、25、50 的轉染效率分別為0.12%、3.62%、42.4%、66.6%、90.4%、98.0%。

5.EGFP-ADSCs 增殖能力檢測：轉染組（MOI＝25）與未轉染組細胞生長情況無顯著差別，呈典型的“S”形生長曲線，第1～2 天處于潛伏期，細胞生長緩慢，第3 天開始進入對數生長期，第7 天生長速度減慢（圖6）。

6.EGFP-ADSCs 誘導分化能力：成骨誘導14天，成脂誘導21 天，成軟骨誘導14 天，相應化學染色結果均為陽性。經多向誘導后，標記細胞依然有綠色熒光蛋白表達（圖7）。

7.EGFP-ADSCs 體內觀察：第 1w，2w，4w 觀察到EGFP 發出的綠色熒光及EGFP 免疫組化陽性細胞，主要集中于移植部位（圖8）。

圖6 轉染組（MOI＝25）與未轉染組（MOI＝0）的生長曲線

圖7 EGFP-ADSCs A1 堿性磷酸酶染色陽性（ ×10），B1 油紅o染色陽性，C1 阿爾辛藍染色陽性（ ×40）.A2，B2，C2：成骨、成脂、成軟骨誘導后EGFP 熒光表達。

圖8 A：HE 染色（ ×4），B：EGFP 熒光（ ×10），C：EGFP 免疫組化（ ×40），1：1w，2：2w，3：4w，4：空白對照。

討 論

間充質干細胞是具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠誘導分化成骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞[5～7]。相比其他來源的干細胞，脂肪干細胞具有獲取方式簡單，相對容易分離，體外擴增能力強，跨胚層分化等優點[8～10]。體外培養的ADSCs 植入機體后能夠向特定的組織分化，在損傷組織修復中發揮重要作用。ADSCs 在植入體內的存活、遷移、分布、轉歸等情況是損傷組織修復涉及到的關鍵問題。因此建立一種有效、穩定的標記ADSCs 的方法顯得尤為重要。

經過大量實驗研究證實，慢病毒攜帶增強型綠色熒光蛋白基因標記干細胞是一種較穩定且對干細胞生物學特性影響較小的標記方法。綠色熒光蛋白（GFP）是一種新型報告基因，不需要輔助因子，在藍光激發下發出綠色熒光，對細胞無毒害，可直接用于活細胞測定[11]。EGFP 是優化突變型GFP，熒光強度是野生GFP 的幾十倍，如果標記細胞死亡，胞質內的EGFP 會迅速擴展到周圍組織并被降解掉，不會出現假陽性[12]。目前，常用的綠色熒光蛋白標記干細胞的方式有3 種：①質粒轉染，操作簡單，但是不能實現穩定轉染[13]。②病毒轉染，表達高效穩定，但可能存在致癌等隱患[14]。③綠色熒光蛋白轉基因動物，雖然沒有上述缺點，但是應用范圍較局限，在小鼠中較為成熟[15]，在稍大動物模型中應用較少。本實驗應用慢病毒作為轉染載體，慢病毒可將外源基因有效整合到宿主染色體中，以持久表達[16]。MOI 與細胞毒性成正比，因此需要優化MOI。為產生高效率表達EGFP 的標記細胞，追蹤細胞在體內的存活、遷移、分化能力，我們采用攜帶EGFP 基因慢病毒載體以不同的MOI 轉染大鼠ADSCs，挑選最適感染復數，并將標記后的細胞植入大鼠皮下，對標記細胞進行追蹤分析，為探討干細胞移植治療作用提供依據。

通過本研究筆者認為攜帶增強型綠色熒光蛋白基因的慢病毒在體外能夠長期有效的標記大鼠脂肪干細胞。

通過對EGFP 標記細胞體內追蹤研究發現同種異體大鼠EGFP-ADSCs 注入皮下后，移植細胞主要分布于注射部位，EGFP 表達隨時間逐漸減弱。本研究發現移植1w 移植處有炎癥細胞浸潤，提示局部有炎癥反應，隨著移植時間延長局部炎癥反應有所減輕。雖有大量文獻報道ADSCs 具有低免疫原性且有免疫調節作用，但并不能完全排除在同種異體大鼠體內植入ADSCs 不會發生免疫排異反應。筆者認為提高移植細胞體內存活率是干細胞移植治療的關鍵，筆者將采用同種同體細胞植入進行下一步研究。