高效液相色譜法同時測定油脂中抗氧化劑TBHQ、BHT及其轉化產物

王 毅，陳華鳳，劉 剛

（1 四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610100）

（2資陽市農產品質量監測檢驗中心，四川 資陽641300）

1 引言

抗氧化劑提供的活潑氫可以與油脂氧化過程中產生的活性自由基結合，阻斷自由基鏈式反應，減緩油脂的氧化變質。一般來說，食品抗氧化劑可分為天然抗氧化劑和合成抗氧化劑兩類[1]。目前天然抗氧化劑主要有維生素類，黃酮類、多酚類、皂苷類、鞣質類等，但天然抗氧化劑提取困難，價格、用量和抗氧化效果都不能滿足現代食品工業的規模生產的需要[2]。相比之下，合成抗氧化劑的種類、價格和抗氧化效果均要優于天然抗氧化劑，目前國際上已開發出上百種化學合成抗氧化劑，但被各國普遍認可、較安全、高效且使用量較大的主要有叔丁基對苯二酚（TBHQ）、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等合成酚類抗氧化劑。我國食品安全國家標準GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》對TBHQ和BHT的最大使用量做出了明確規定（≤0.2g/kg）[3]。

在諸多合成酚類抗氧化劑中，TBHQ在同等情況下的抗氧化劑性能優于其他抗氧化劑，BHT價格較低，化學性質穩定，且遇堿不變色，可以與TBHQ互補使用，基于以上優點，TBHQ和BHT往往單一或者聯合用于油脂制品的抗氧化[4]。實驗證實，在加熱條件下，油脂中的TBHQ和BHT主要以揮發為主[5-6]。此外，還有少量的轉化產物生成。近年來，國內外學者陸續開展了TBHQ和BHT在加熱條件下轉化產物的研究，Hamama[7]和李軍等[8]對含有TBHQ的油脂進行加熱實驗，實驗結果表明：TBHQ加熱時的主要轉化產物是2-叔丁基對苯醌（TQ）。Warner等[9]證實BHT經高溫加熱后會有2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q）生成，Hamama等[7]將BHT置于185℃高溫下加熱1h后，通過GC-MS測試發現了轉化產物2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP）。

盡管TBHQ和BHT轉化產物的研究取得了一些成果，但分析檢測方法鮮有報道[10]。文中在前期研究的基礎上，以TBHQ、BHT轉化產物TQ、BHT-Q和TBP作為主要分析對象，建立了高效液相色譜同時檢測TBHQ、BHT及其特征轉化產物的分析方法，以期實現對TBHQ和BHT使用全過程的監控。

2 材料與方法

2.1 實驗儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（DAD檢測器、二元泵、柱溫箱、自動進樣器、Chemical Station 色譜工作站，美國Agilent公司）；TI-H5MF2型超聲波清洗器（德國Elma公司）；Milli-Q純水系統（美國 Millipore公司）；H2050R型高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；FA2004N型分析天平（感量0.0001g）（上海菁華公司）。

2.2 實驗試劑耗材

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）、超純水（Milli-Q純水系統制備）、微孔濾膜（有機系，0.22μm）、色譜柱：Sunfire C18，4.6mm×250mm，5μm（美國Waters公司）；ODS C18吸附劑,50μm, 60?, 100g（天津博納艾杰爾科技有限公）。

2.3 對照品

叔丁基對苯二酚（TBHQ，純度≥97.8%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，純度≥99.9%）、2-叔丁基對苯醌（TQ，純度≥98.0%）購至上海安譜實驗科技股份有限公司；2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP，純度≥99.0%）和2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q，純度≥99.0%）購至北京百靈威科技有限公司。

2.4 色譜分析條件

色譜柱：Sunfire C18, 4.6mm×250mm,5μm；柱溫：40℃；進樣量：10μL；檢測波長：280nm；流動相：（A水，B乙腈），運行梯度洗脫程序：0.00min～3.00min 45%A～45%A，3.00min～7.00min 45%A ～ 25%A，7.00min～ 7.50min 25%A～2%A，12.00min～12.10min2%A ～45%A，12.10min～ 16.00min45%A ～ 45%A。

2.5 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：精密稱定TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP標準物質0.0250g，乙腈溶解并定容至25mL，得到濃度為1000mg/L的標準儲備液，4℃避光保存。

標準工作液的配制：分別準確吸取1mL TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP的標準儲備液（1000 mg/L）于10mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至10mL，得到質量濃度為100mg/L 的標準使用液。逐級稀釋標準使用液得到質量濃度分別為0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0 mg/L的標準溶液。

2.6 提取與凈化

準確稱取1.0g油樣于在50mL離心管中，加入5mL正己烷，渦旋1min，加入5mL正己烷飽和乙腈超聲提取10min，冷凍離心10min，收集乙腈層于離心管中，重復用10mL正己烷飽和乙腈提取2次，合并3次提取液，提取液-10℃冷凍2h后加入5g C18吸附劑，振蕩提取10min，冷凍離心，過濾除去C18粉末，收集濾液40℃旋轉蒸發至干，加入1ml乙腈溶解殘渣，過0.22μm有機濾膜，供液相色譜測定。

3 結果與討論

3.1 加熱條件下TBHQ和BHT轉化產物的可能轉化機理

如圖1所示，氧化反應初期，TBHQ和BHT均可失去一個氫生成酚氧自由基中間體（中間體II和中間體IV），其中TBHQ的酚氧自由基中間體IV通過分子內電荷轉移可以生成較穩定的轉化產物TQ。BHT的酚氧自由基中間體II與III互為共振式，中間體III與過氧化物作用，通過分子內消除反應生成穩定的轉化產物BHT-Q。

BHT的轉化還有另外一條途徑，活性氫首先對BHT的苯環親電加成，生成中間體I，隨后脫去叔丁基生成轉化產物TBP。

圖1 加熱條件下TBHQ和BHT轉化產物的可能轉化機理

3.2 樣品前處理方案的選擇與優化

油脂制品前處理時加入正己烷可以降低體系的粘度，這將有利于待測化合物的提取。此外，利用極性溶劑與油脂不相溶的特性，可以使用極性溶劑提取油脂中的待測極性組分[11]。前期研究結果表明，乙腈的提取效果優于甲醇[12-13]，為了降低乙腈在正己烷中的溶解性，本實驗采用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。

一般來說，脂類等非極性組分是樣品提取過程中的主要干擾物，文獻報道采用中性氧化鋁柱[14-15]，C18柱[16]等固相萃取方式凈化除去。雖然固相萃取的凈化效果較好，但實驗成本較高，耗時較長，不利于大批量樣品的快速檢測。此外，凝膠滲透色譜[17]也用于了樣品前處理的研究，需要指出的是，該方法不但耗時長，而且凈化過程中還會用到大量的有機溶劑，對環境的污染極大。因此，上述前處理方法均不利于實驗室大批量樣品的檢測。隨著QuEChERS技術的出現，快速、高效、低毒的前處理方式得到了人們的推崇，2018年，陳果等[18]設計了基于QuEChERS原理的前處理方案，采用C18-MgSO4作為凈化劑，C18反相色譜柱分離，獲得了理想的結果，各組分的回收率均在90%以上。筆者在研究中發現MgSO4不是凈化油脂所必須的成分（MgSO4主要用于吸附樣品中多余的水分，但油脂制品中幾乎不含水），在多次實驗的基礎上，提出了冷凍離心-C18吸附凈化的方案。實驗證實，該方法具有快速、簡便、易操作，成本低廉的優點，有利于實驗室大批量樣品的快速檢測。

3.3 液相色譜條件選擇與優化

已有較多的文獻報道了TBHQ和BHT的液相色譜分離條件：使用甲醇/乙腈作為有機相，通過加入了不同比例的鹽[19]、酸[20-21]改善化合物的分離和峰形。筆者首先嘗試使用甲醇作為有機相，1.0%乙酸-水作為水相進行分離，BHT和BHT-Q在此色譜條件下不能達到基線分離，有機相換用乙腈后，BHT和TBHQ獲得了較好的分離。為了減少酸體系對色譜柱的損害，提高色譜分析系統的穩定性，筆者嘗試使用純水代替1.0%乙酸-水。如圖2所示，TBHQ、BHT及其轉化產物在該色譜條件下均獲得了較好的分離效果。

圖2 TBHQ、BHT及其轉化產物的液相色譜分離圖譜

3.4 方法線性范圍

分別配制TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP不同濃度梯度的標準溶液，其濃度依次為0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0mg/L，按照2.4所示的色譜條件進行檢測，以峰面積（y）為縱坐標，濃度（x，mg/L）為橫坐標繪制標準工作曲線，各組分的線性回歸方程見表1所示。測試結果表明，在0.5mg/L～50.0mg/L范圍內，TBHQ、BHT及其轉化產物具有良好的線性關系，相關系數（2）大于 0.999。

表1 本方法的回歸方程、相關系數

3.5 方法精密度、回收率和檢出限

本實驗采用空白大豆油加標的方式進行方法精密度、回收率和檢出限實驗。TBHQ、BHT及其轉化產物的添加水平為1.0mg/kg、10.0mg/kg，按2.4所示的色譜條件，2.6所示的前處理方法進行實驗，每一樣品重復平行測定6次。測試數據見表2所示，TBHQ、BHT及其轉化產物的回收率在72.6%～101.2%之間，相對標準偏差（RSD）小于4.5%，檢出限范圍為3mg/kg～10mg/kg。

表2 回收率、精密度和檢出限測定結果（平行測定6次）

4 結論

文中建立了同時測定TBHQ、BHT及其轉化產物（TQ、BHT-Q、TBP）的前處理方法以及高效液相色譜定量分析方法。該方法簡單易操作，重現性較好，適用于實驗室大批量樣品的快速檢測，通過檢測TQ、BHT-Q、TBP的含量，可以有效避免現行檢測方法測定TBHQ和BHT時檢測結果比實際測定值偏低的缺陷。