PTHrP、MCT1信號通路對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)機(jī)制研究

賀黎升　馬麗梅　羅金風(fēng)　段艷

[摘要] 目的 研究探討甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族1（MCT1）信號通路對非小細(xì)胞肺癌衰老的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 將2014年5月—2018年5月在該醫(yī)院培養(yǎng)的80孔非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞分為A、B、C、D共4組，每組20孔。其中A組細(xì)胞中加入PTHrP信號通路抑制劑、B組細(xì)胞加入MCT1信號通路抑制劑、C組細(xì)胞加入PTHrP信號通路激活劑、D組細(xì)胞加入等量的PBS培養(yǎng)液，4組細(xì)胞經(jīng)聯(lián)系72 h培養(yǎng)。采用β-半乳糖苷酶染色法（β-Gal）觀察4組細(xì)胞的衰老程度。對4組細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測PTHrP mRNA、MCT1 mRNA的表達(dá)量。并對各組細(xì)胞中pHi染色小體的和細(xì)胞外乳酸水平進(jìn)行檢測比較。并采用Pearson檢驗(yàn)對各指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 ①4組細(xì)胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D組（10.09±2.98）%，C組陽性率（8.29±2.10）%則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②4組細(xì)胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量[（7.09±1.53）、（5.29±1.22）;（7.26±1.61）、（4.98±1.17）]低于D組[（9.13±1.98）、（7.19±1.68）]，而C組表達(dá)率[（12.32±2.09）、（9.57±1.98）]則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。③4組細(xì)胞的pHi染色小體的和細(xì)胞外乳酸水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細(xì)胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。④ Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，各組細(xì)胞的β-Gal染色陽性率（即衰老程度）與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，與pHi染色小體水平呈正相關(guān)性，與細(xì)胞外乳酸水平呈負(fù)相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論P(yáng)THrP、MCT1信號通路狀態(tài)可以對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的衰老起到調(diào)節(jié)作用，PTHrP、MCT1間相互影響，共同調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;細(xì)胞衰老;甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白;單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族1

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）07（c）-0030-04

Regulatory Mechanism of PTHrP and MCT1 Signaling Pathway on Senescence of Non-small Cell Lung Cancer Cells

HE Li-sheng1， MA Li-mei2， LUO Jin-feng1， DUAN Yan1

1.Department of Pathology， Shenzhen People's Hospital， Shenzhen， Guangdong Province， 518020 China; 2.Department of Pathology， Third People's Hospital of Zigong City， Zigong， Sichuan Province， 643020 China

[Abstract] Objective To investigate the regulation mechanism of parathyroid hormone-related protein （PTHrP） and monocarboxylate transport pump family 1 （MCT1） signaling pathway on the senescence of non-small cell lung cancer. Methods The A549 cells of 80-well non-small cell lung cancer cultured in People's Hospital from May 2014 to May 2018 were divided into 4 groups： A， B， C， and D， each with 20 holes. In group A， PTHrP signaling pathway inhibitor was added， group B cells were added with MCT1 signaling pathway inhibitor， group C cells were added with PTHrP signaling pathway activator， group D cells were added with equal amount of PBS medium， and four groups of cells were cultured for 72 h. The degree of senescence of the four groups of cells was observed by β-galactosidase staining （β-Gal）. Four groups of cells were subjected to PCR amplification， and the expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The pHi staining and extracellular lactate levels in each group of cells were detected and compared. Correlation analysis was carried out between the indicators using the Pearson test. Results 1.There was a statistically significant difference（P<0.05） in the positive rate of β-Gal staining between the four groups. The positive rate of group A and group B （13.98±2.53）% and （14.23±3.21）% were higher than those of group D （10.09±2.98）%. The positive rate of group C （8.29±2.10）% was lower than that of group D， and there was significant significant difference between the groups （P<0.05）. 2.The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in the four groups of cells were statistically significant（P<0.05）. The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in group A and group B were （7.09±1.53）， （5.29±1.22）; （7.26±1.61）（4.98±1.17）]， lower than group D [（9.13±1.98）， （7.19±1.68）]， and the expression rate of group C [（12.32±2.09）， （9.57±1.98）]， higher than group D， and there were significant significant differences between the groups （P<0.05）. 3.There were significant significant differences in pHi staining and extracellular lactate levels between the three groups of cells. The pHi staining level of group A and group B was higher than that of group D， and that of group C was lower than that of group D， group A and group B. The level of external lactate was lower than that of group D， and that of group C was higher than that of group D. There was statistically significant difference between groups （P<0.05）. 4.Pearson correlation test showed that the positive rate of β-Gal staining （ie， aging） of each group was negatively correlated with the expression of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA， and positively correlated with the level of pHi staining， and the level of extracellular lactate of negative correlation （P<0.05）. Conclusion The state of PTHrP and MCT1 signaling pathway can regulate the senescence of non-small cell lung cancer cells. PTHrP and MCT1 interact with each other to regulate the lactic acid transport process of lung cancer cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Cell senescence; Parathyroid hormone-related protein; Monocarboxylic acid transport pump family 1

肺癌是臨床上發(fā)病率較高的惡性腫瘤疾病，對人類健康的威脅性很大，在眾多的肺癌患者中以非小細(xì)胞肺癌最為多見，約占肺癌臨床患者的80%左右。隨著對人類生命健康威脅程度的加深，研究人員對非小細(xì)胞肺癌發(fā)病、病情進(jìn)展等機(jī)制的研究不斷深入，其中非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞衰老過程的引起了更多的關(guān)注[1]。相關(guān)報(bào)道顯示[2-3]，非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物標(biāo)記物的水平的改變會對患者癌細(xì)胞的衰老過程發(fā)揮一定的作用。其中，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（Parathyroid hormone related protein， PTHrP）、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族1（Monarboxylic acid transfer pump family 1， MCT1）信號通路開放過程可能對非小細(xì)胞肺癌衰老過程有一定的調(diào)控作用[4-5]。為了進(jìn)一步證實(shí)這一臨床推斷，以便更好地了解非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，以期能夠?yàn)樵擃惏┌Y的治療提供依據(jù)。在該研究選取2014年5月—2018年5月該醫(yī)院提供培養(yǎng)得到的80孔非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，分別加入THrP信號通路抑制劑、MCT1信號通路抑制劑、PTHrP信號通路激活劑，觀察其對癌細(xì)胞衰老的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料與方法

1.1? 材料和儀器

材料：非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自于中科院上海細(xì)胞生物研究所;PTHrP、MCT1試劑盒、RNA提取試劑盒、β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色試劑盒、乳酸檢測試劑盒等均購置于賽默飛世爾科技有限公司。儀器：KS48型PCR擴(kuò)增儀（冠森生物科技（上海）有限公司）;A8543紫外分光光度計(jì)（美國安捷倫科技有限公司）;CX-31型電子顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2? 研究方法

取非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞80株分為A、B、C、D共4組，其中A組細(xì)胞中加入PTHrP信號通路抑制劑、B組細(xì)胞加入MCT1信號通路抑制劑、C組細(xì)胞加入PTHrP信號通路激活劑、D組細(xì)胞加入等量的PBS培養(yǎng)液，4組細(xì)胞經(jīng)聯(lián)系72 h培養(yǎng)。對各種細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行β-Gal染色，經(jīng)漂洗、固定、孵育48 h后于顯微鏡下觀察，在視野下觀察并隨機(jī)選取100個(gè)染色細(xì)胞，測定每個(gè)細(xì)胞中的染色面積并與細(xì)胞總面積進(jìn)行對比，取比值作為染色陽性率，即表示為細(xì)胞的衰老程度。然后采用熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測各組細(xì)胞中的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)水平。并采用熒光分光光度法對各組細(xì)胞的pHi染色小體的和細(xì)胞外乳酸水平。各檢查方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.3? 評價(jià)指標(biāo)

對4組細(xì)胞的β-Gal染色陽性率、PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量、細(xì)胞pHi、乳酸水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，并對β-Gal染色陽性率與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量、細(xì)胞pHi、乳酸水平間相關(guān)性進(jìn)行分析探討。

1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料、計(jì)數(shù)資料分別用（x±s）、[n（%）]表示，組別比較分別采用t檢驗(yàn)/F檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 各組β-Gal染色陽性率比較

4組細(xì)胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率均高于D組，C組陽性率則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2? 各組PTHrPmRNA、MCT1mRNA表達(dá)量比較

4組細(xì)胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量低于D組，而C組表達(dá)率則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3? 各組細(xì)胞pHi、乳酸水平比較

4組細(xì)胞的pHi染色小體的和細(xì)胞外乳酸水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細(xì)胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4? Pearson相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，各組細(xì)胞的β-Gal染色陽性率（即衰老程度）與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，與pHi染色小體水平呈正相關(guān)性，與細(xì)胞外乳酸水平呈負(fù)相關(guān)性（P<0.05），見表4。

3? 討論

PTHrP、MCT1是兩種人體常見的生物標(biāo)記蛋白，其中PTHrP為甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白，是甲狀腺內(nèi)分泌過程形成的一種蛋白標(biāo)記物，其在各種癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的信號通路的介導(dǎo)作用[6-7]。具體的主要是通過影響癌細(xì)胞的細(xì)胞周期性，并由此對癌細(xì)胞的增殖、生長及凋亡過程產(chǎn)生一定的作用，當(dāng)其在體內(nèi)的水平升高時(shí)，PTHrP信號通路大量被激活，癌細(xì)胞的增殖生長過程加快，反之當(dāng)PTHrP水平下調(diào)時(shí)，PTHrP信號通路關(guān)閉，癌細(xì)胞增殖生長過程被抑制，加速了癌細(xì)胞的衰老和凋亡過程[8]。這種PTHrP信號通路的調(diào)節(jié)過程的變化能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長能力，并可能改變腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力和腫瘤細(xì)胞的衰老過程[9]。MCT1是單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族中的一種，主要分布在患者體內(nèi)癌細(xì)胞的表面，對癌癥患者的癌細(xì)胞的乳酸有較好的親和力，通過與乳酸結(jié)合后的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而加速腫瘤細(xì)胞的代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞衰老凋亡過程[10]。

在該研究中，4組細(xì)胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D組（10.09±2.98）%，C組陽性率（8.29±2.10）%則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，4組細(xì)胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量低于D組， C組表達(dá)率則高于D組。而4組細(xì)胞的pHi染色小體的和細(xì)胞外乳酸水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細(xì)胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組。以上結(jié)果均表明PTHrP、MCT1水平增加，相應(yīng)的信號通路被激活，導(dǎo)致β-Gal染色陽性率降低，衰老細(xì)胞表達(dá)減少。這與李永頔等[11]學(xué)者在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中得出，細(xì)胞中加入PTHrP信號通路抑制劑的β-Gal染色陽性率（13.65±2.47）%、細(xì)胞加入MCT1信號通路抑制劑的β-Gal染色陽性率（13.68±3.31）%、細(xì)胞加入PTHrP信號通路激活劑的β-Gal染色陽性率（8.35±2.05）%、細(xì)胞加入等量的PBS培養(yǎng)液的β-Gal染色陽性率（10.15±2.30）%的結(jié)果相近。當(dāng)加入PTHrP、MCT1抑制劑后，衰老細(xì)胞顯著增加，加速癌細(xì)胞的凋亡[12]。而各組細(xì)胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量、pHi染色小體水平、外周乳酸水平的變化，表明了這些指標(biāo)的表達(dá)過程參與了PTHrP、MCT1信號通路對癌細(xì)胞衰老凋亡的影響過程[13-14]。相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞的β-Gal染色陽性率與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，與pHi染色小體水平呈正相關(guān)性，與細(xì)胞外乳酸水平呈負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步表明癌細(xì)胞衰老過程受PTHrP、MCT1信號通路調(diào)控，并與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達(dá)、pHi染色小體和細(xì)胞外乳酸水平相關(guān)。

綜上所述，當(dāng)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)PTHrP、MCT1信號通路被激活，mRNA表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞pHi水平降低，外周乳酸水平升高，進(jìn)而使得非小細(xì)胞肺癌患者衰老細(xì)胞數(shù)量降低。因此，通過對PTHrP、MCT1信號通路狀態(tài)的抑制條件，共同抑制肺癌細(xì)胞的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程，加速非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的衰老。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 穆艷超.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NUPR1調(diào)控非小細(xì)胞肺癌自噬溶酶體途徑的機(jī)制[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)， 2017.

[2]? 高文濤，徐小瑩，杜志強(qiáng)，等.規(guī)律運(yùn)動(dòng)影響AD模型小鼠腦內(nèi)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)并改善認(rèn)知功能[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2017，33（4）：390-396.

[3]? 孫澤輝，張彥.非小細(xì)胞肺癌的化療聯(lián)合免疫治療中樹突狀細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞間對話調(diào)控的機(jī)制研究[J].臨床肺科雜志，2016，21（6）：1089-1092.

[4]? 張配，劉芳，高嬌，等.抑制單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（7）：883-888.

[5]? Tan Y，Hu H，Tan W，et al.MicroRNA-138 inhibits migration and invasion of non-small cell lung cancer cells by targeting LIMK1[J].Molecular Medicine Reports，2016，14（5）：4422-4428.

[6]? 王自義，汪鑫，劉曉南，等.單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SNP與肝細(xì)胞肝癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（25）：4840-4846.

[7]? 壽記新，高海東，管海博，等.單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)及相關(guān)性[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33（2）：545.

[8]? 劉雯雯，方寧遠(yuǎn).易普利姆瑪對Lewis肺癌小鼠體內(nèi)PTHrP表達(dá)的影響及與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系[J].實(shí)用癌癥雜志，2017，32（7）：1052-1055.

[9]? Walton J C.Functionalised Oximes： Emergent Precursors for Carbon-，Nitrogen- and Oxygen-Centred Radicals[J].Molecules，2016，21（1）：63-68.

[10]? Olsen I H，Langer S W，F(xiàn)ederspiel B H，et al.（68）Ga-DOTATOC PET and gene expression profile in patients with neuroendocrine carcinomas： strong correlation between PET tracer uptake and gene expression of somatostatin receptor subtype 2[J].American Journal of Nuclear Medicine & Molecular Imaging，2016，6（1）：59-65.

[11]? 李永頔，唐正龍.大鼠成骨細(xì)胞增殖及護(hù)骨素蛋白含量與甲狀旁腺激素的調(diào)節(jié)效應(yīng)[J].現(xiàn)代診斷與治療，2016，27（16）：2948-2950.

[12]? 杜春荔，楊秉潛，何春戈，等.終末期腎病患者甲狀旁腺激素與肌鈣蛋白水平的相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué)，2016，27（4）：534-536.

[13]? 劉雯雯，方寧遠(yuǎn).Lewis肺癌小鼠體內(nèi)PTHrP表達(dá)與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（5）：705-708.

[14]? 劉雯雯，方寧遠(yuǎn).甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族1信號通路對肺腺癌細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2017，57（23）：4-7.

（收稿日期：2019-04-25）