基于SSR標記的MCID法鑒定72個釀酒葡萄品種

傅偉紅，魏新科，葛孟清，劉崇懷*，房經貴*

（1. 南京農業大學園藝學院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 中國農業科學院鄭州果樹所，河南鄭州 450009）

葡萄栽培歷史悠久，品種繁多。目前，已發現的葡萄屬種質資源有70多個種，已登記的品種有1.6萬個，而中國種質資源圃中保存的大約有2000多種[1-2]。葡萄在自然條件下極易產生芽變，同時在長期人為活動如引種、選種、交換、栽培中也易發生混亂，同名異物或同物異名現象非常嚴重。而且隨著栽培范圍的擴展，育成種質數目呈快速增長趨勢，使得葡萄的選育和推廣面臨許多困難[3]。

本文所選的72個品種包括國內自育品種以及許多國外引進的優良品種，大部分是品質優良的釀酒品種，還有一些是釀酒鮮食兼用品種，在我國葡萄與葡萄酒產業的發展中具有重要地位。傳統的形態學鑒定由于易受環境條件的影響，已逐漸不能滿足需求[4]，因此繪制直觀可靠的品種鑒定圖，對于苗木早期鑒定、品種權利保護、生產中品種的區分和命名以及葡萄種質資源的評價等具有重要的實際意義[5-6]。

DNA分子標記是以個體間核苷酸差異為基礎，建立在分子水平上的遺傳標記技術，在植物育種和遺傳資源管理中有著廣泛的應用[7-8]。DNA分子標記具有高度專一性和特異性、信息量大，還有操作方便、遺傳穩定、不受環境因素影響等優點，且與形態、生理和生化指標等方法比較，其在鑒定作物新品種及檢測種子純度方面具有很大優勢[9-12]。但是，由于缺乏可以將DNA指紋轉化為品種區分信息的理想措施，無法使其在品種鑒定中的優勢發揮出來，以往利用二元表與進化樹等呈現不同植物材料或品種的鑒定結果，僅僅表達DNA標記能夠區分這些品種的技術優勢，但難以提供用于區分這些品種可依據的實用性的鑒定結果。

MCID法（Manual cultivar identification diagram）是一種新的基于DNA分子標記的人工繪制品種鑒別示意圖的方法。該方法對同一引物PCR擴增后的多態性譜帶進行分類，把電泳后具有相同譜帶的分為同一組，有特異性譜帶的則被區分出來，在圖上標記相應的引物和譜帶，從而繪制準確、直觀、實用的品種鑒定圖[13]。MCID方法的應用不僅可以使RAPD、SSR等DNA標記在鑒定果樹品種中的利用成為實用性的簡便工具，更使DNA標記技術在果樹乃至生物樣品鑒定中的優勢得到了充分實現[14]。該方法真正意義上將DNA指紋技術鑒定品種獲得的結果轉化為簡便、利用價值很高的能具體指導品種鑒定實踐的實用信息，最終獲得的品種鑒定圖（CID）能夠成為植物品種快速鑒定的依據。該方法已經在多種植物品種的分類、種質資源的遺傳基礎研究、遺傳圖譜的構建等方面較為廣泛地應用。孫鈞等[13]利用5對SSR多態性引物成功鑒定了14份白沙枇杷資源，并構建了相應品種鑒定圖譜。黃丹娟等[15]基于SSR熒光標記的MCID法鑒定了13種茶樹品種。許園園等[16]基于RAPD擴增，利用MCID方法對20個蘿卜品種進行鑒定，同時進行遺傳多樣性分析。

本研究利用國際通用的6對SSR引物，結合MCID法對待鑒別的72個釀酒葡萄品種的DNA進行PCR擴增，對SSR結果進行分子鑒定和初步的遺傳多樣性分析，繪制品種鑒定圖，以期將72個品種在分子水平準確地區分，同時為釀酒葡萄品種鑒定與資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的72種釀酒葡萄品種的試驗材料均來源于中國農業科學院鄭州果樹研究所。選取的材料為國內釀酒葡萄品種以及常見國外釀酒品種的新梢幼葉，裝入冰盒之中帶回實驗室，之后先用蒸餾水洗干凈葉片，去除葉脈并用吸水紙吸干，用液氮速凍然后置于-40 ℃冰箱暫時保存。葡萄品種詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取葉片50 mg研磨成粉末，轉移到1.5 mL離心管中。采用傳統CTAB法提取樣品的基因組DNA，使用核酸蛋白測定儀（Nano-100）測定DNA樣品濃度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質量。并用ddH2O稀釋至50 ng/μL于-20 ℃保存備用，初始濃度的DNA同樣在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 引物篩選與構建

試驗參照國際葡萄品種目錄數據庫（Vitis Internationl Variety Catalogue, VIVC, http://www.vivc.de/）公布的9對葡萄國際通用引物進行篩選分析，引物序列由通用生物公司合成。選擇3個遺傳差異較大的葡萄DNA對9對引物進行篩選，經過PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳，從中選取擴增條帶清晰穩定、多態性好的引物用于所有DNA 樣品的擴增。引物序列及退火溫度見表2。

表1 供試葡萄品種介紹Table 1 Grape cultivars used in this study

表2 SSR引物及退火溫度Table 2 The SSR primers and annealing temperature used in this study

1.2.3 PCR擴增與檢測

PCR反應液體系為25 μL，其中含DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×Hieff PCR Master Mix（YEASEN公司生產）12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環，最后72 ℃延伸10 min，保存4 ℃保存。

1.2.4 PCR產物電泳檢測

SSR-PCR產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）中電泳分離，用雙蒸水清洗電泳后的凝膠，清洗完畢用0.2% AgNO3溶液震蕩染色2 min，之后置于顯色液中進行顯色反應，顯色液配方為1.5%NaOH:37%甲醛=300:1。直至條帶清晰，在燈光下對條帶進行觀察并做好記錄、統計，用相機拍照后保存圖像用于后續分析制作CID。

1.2.5 數據統計與分析

將SSR分子標記統計基因型轉化為0-1數據，先在電泳圖上選取一個長度，將在同一分子量上，有特征條帶的記為1，沒有條帶的記為0，數據缺失記為9，以此得到數據庫。利用NTSYS-pc 2.10e軟件中Similarity選項下的Qualitative data模塊得到遺傳相似系數矩陣，由遺傳相似系數矩陣在Clustering選項中的SHAN模塊，進行UPGMA聚類分析，通過Tree plot程序得到聚類圖。

1.2.6 人工繪制植物品種鑒別圖法

在PCR反應產物中選取能擴增出清晰條帶的引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以此鑒定72個釀酒葡萄品種。首先選擇其中某一對引物的PCR擴增電泳圖譜，對在相同電泳遷移率處（相同分子量片段）的特異性條帶進行多態性統計，有擴增譜帶的品種歸類為一組，沒有譜帶的歸類為另一組。通過這種方法，擴增后能產生唯一特異性條帶的品種就可以首先被區分鑒別出來，其余具有相同大小帶型的品種則被分成幾個不同的亞組。再通過其他更多引物逐級區別每個亞組中的品種，直至所有待鑒別的品種都被單獨區分。最后，通過對比譜帶后獲得的分組信息，人工繪制直觀的品種鑒別圖譜，在樹形鑒別圖上將每一次篩選用的引物以及多態性譜帶大小逐一進行標記[9,16-17]。人工繪制的植物品種鑒別圖是在PCR擴增后，對獲得的譜帶形態進行分析，以引物作為節點，以特征譜帶的有無作為分類的依據，充分、直觀地反映出6對通用引物鑒別區分72個釀酒葡萄品種的圖譜關系。

圖1 引物組合VvMD27擴增72個釀酒葡萄品種Figure 1 Primer VvMD27 amplification of 72 wine grape varieties

2 結果與分析

2.1 PCR引物篩選結果

初步選擇9對擴增條帶清晰且多態性好的引物（VvS2、VvMD5、VvMD7、VvMD25、VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvMD62、VvMD79），通過統計，從中篩選出6對引物進行CID的制作（VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvS2、VvS7、VvS5）。圖1是引物組合VvMD27對72個品種的擴增電泳圖，分析可見，這些引物均能在供試樣品中擴增出清晰、穩定、重復性和多態性較高的條帶。說明對應編號的引物都可為SSR引物篩選提供參考。

2.2 遺傳多樣性分析

以從9對引物組合中篩選的擴增條帶清晰且有明顯多態性片段的8對引物的SSR擴增產物為基礎，通過NTSYS-pc 2.10e 軟件得到72個釀酒葡萄品種的聚類圖（圖2）。

由圖2分析可知，分子標記可以有效的將72個釀酒葡萄品種區分開。在遺傳相似系數為0.52左右時，可以分為4個類群，其中，類群Ⅰ包含20個品種，類群Ⅱ包含13個品種，類群Ⅲ包含14個品種，類群Ⅳ包含25個品種，表明大多數材料之間存在著顯著的遺傳差異。以類群Ⅱ中的15份材料為例，‘小黑葡萄’（4）、‘西爾瓦’（11）、‘黑格蘭’（32）、‘艾布林’（14）、‘白比諾’（15）、‘佳利釀’（36）、‘黑佳釀’（7）、‘阿利戈特’（12）、‘貴人香’（30）、‘黑佳美’（33）、‘紅玫瑰’（34）共11個歐亞種被聚類在這個類群，但是歐美雜種‘巴柯’（5）和歐山雜種‘北玫’（21）也被聚在了類群Ⅱ中。其中有5個品種來源于法國，3個品種來源于中國，2個品種來源于德國，2個品種來源于西班牙，1個品種來源于保加利亞。以上結果說明這13份材料的遺傳多樣性與其所屬種有一定關系，而與地理來源關系不大。

由于聚類分析產生的樹狀圖和系統發育樹無法顯示特定的引物和多態性標記等可參考的信息，限制了分子標記在品種鑒定中的實際應用。葡萄品種鑒定是一個重要研究領域，隨著葡萄品種的不斷增多，想要對這些釀酒葡萄進行正確的鑒定與分類的需求也越來越迫切。因此，建立一個快速、簡便、切實可用的分析措施將會使DNA分子標記在品種鑒定中發揮重要作用[18]。

2.3 釀酒葡萄品種鑒定

利用SSR建立72個釀酒葡萄的MCID，結合篩選的6對引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，運用MCID法將72個品種逐一單獨區分鑒別出來。為了觀圖簡潔方便，將每個品種的編號用對應的數字表示。

首先根據引物VvMD27擴增的電泳圖上大小為250 bp、310 bp和370 bp的3條特征性條帶的有無將72個品種分成7組，將有特征性譜帶的用(+)表示，沒有特征性譜帶的用(-)表示。第1組是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(-)，包括9個品種；第2組為250 bp(+)、310 bp(+)和370 bp(-)，包括15個品種；第3組是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(+)，包括5個品種；第4組只有310 bp譜帶，缺失250 bp和370 bp譜帶，包括7個品種；第5組是250 bp(-)、310 bp(+)和370 bp(+)，包括8個品種；第6組只有370 bp譜帶的分組，包括10個品種；第7組為3條特征性譜帶250 bp、310 bp和370 bp均不含有的共18個品種。

利用引物VvMD27將72個品種分為7類之后，繼續利用更多的引物分別鑒定7個組的所有品種。以第2組的15個品種為例，先利用引物VvMD28進行擴增，首先鑒定出同時具有250 bp、330 bp兩條多態性譜帶的‘小黑葡萄’（4）。其余14個品種被分成3組，有250 bp譜帶，沒有330 bp譜帶的為2-1組，包括6個品種；有330 bp譜帶，沒有250 bp譜帶的為2-2組，包括3個品種；兩條譜帶均沒有的為2-3組，包括5個品種。再利用引物VvMD32進行擴增，只有240 bp條帶，缺失350 bp條帶的‘甲州’（37）被鑒定出來；同時具有240 bp和350 bp條帶的是‘北醇’（19）、‘卡拉’（38）、‘長相思’（44）；只有350 bp條帶，缺失240 bp條帶的為‘郁金香’（53）和‘小白’（61）。之后繼續利用引物VvS2擴增，有200 bp條帶，缺失260 bp條帶的‘長相思’（44）被單獨鑒定出來；有260 bp條帶，缺失200 bp條帶的為‘北醇’（19）和‘卡拉’（38）兩個品種。最后通過引物VvS7進行擴增，具有250 bp條帶的為‘卡拉’（38），缺失250 bp條帶的為‘北醇’（19）。2-2組和2-3組的品種同樣可以利用VvMD32和VvS2分別鑒定。

其他6組按照此方法依次鑒定，利用6對引物就可以區分所有品種。最后，根據所有引物及相應譜帶信息繪制72個品種的鑒定圖，即釀酒葡萄品種CID（圖3）。

MCID是一種可以簡單快速地鑒別任何品種的方法，具體步驟是先根據擴增條帶的有無以及多態性篩選待鑒定品種區分所需引物，利用篩選出的引物進行PCR擴增，最后對PCR擴增的多態性條帶進行分析觀察，分步將待鑒定品種區分出來。例如：區分‘香寶馨’（2）和‘晚紅蜜’（45）2個釀酒葡萄品種，在MCID中分別找到品種對應數字2和45。我們發現，用引物組合VvS7即可區分2個品種，利用該引物對，‘香寶馨’在250 bp處有特異性條帶，而‘晚紅蜜’則沒有，簡單快速達到區分品種的目的。同樣，如果區分‘西爾瓦’（11），‘阿利戈特’（12）和‘灰比諾Fr70/125A’（35）3個品種時，首先在MCID上得到3個品種最先分支的引物為VvS2，多態性條帶為260 bp和200 bp，通過該引物可將3個品種分為‘阿利戈特’（12）、‘西爾瓦’（11）與‘灰比諾Fr70/125A’（35）兩組，之后再利用VvS7引物和250 bp條帶將‘西爾瓦’與‘灰比諾Fr70/125A’區分，這樣3個品種就能完全區分。

圖2 72個釀酒葡萄品種基于SSR分析的聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram of the 72 wine grape varieties on the basis of SSR markers

3 討論與結論

葡萄是世界上重要的果樹之一。在葡萄生產中，對獲取的優良新品種進行保護時，該品種應被鑒定，與已有品種準確區分[19]。隨著葡萄與葡萄酒產業的擴大，對釀酒葡萄資源的收集評價、特異種質的挖掘變得尤為重要，這就需要找到一種兼具準確性和實用性的植物品種鑒定方法。DNA分子標記技術與形態標記、細胞學標記和生化標記相比，優越性明顯，具體表現在多態性高、數量極多、不影響目標性狀的表達等方面[20]。一些DNA標記技術例如SSR、ISSR、RAPD、AFLP等因其各自的優勢特點，已經被廣泛地應用于各類植物遺傳多樣性分析與種質鑒定工作中。

圖3 6對引物鑒別區分72個釀酒葡萄品種的MCID示意圖Figure 3 MCID of 72 wine grape varieties by using six pairs of SSR primers

以上的DNA分子標記技術多在構建指紋圖譜后利用聚類分析進行品種之間遺傳差異的探究，無法作為品種鑒定的根本依據。而MCID法很好地解決了品種鑒定的問題，一般只需要幾對引物就能鑒定較多品種，且操作簡單、直觀有效、穩定性高、實用性強[21]。目前MCID 法已經被用于多個樹種的鑒定，如利用基于SSR標記的MCID法鑒定白沙枇杷、茶樹、柿等[13,15-16]，基于RAPD標記的MCID法鑒定葡萄、青花菜等[17,22]，這些研究都表明了MCID法在鑒定品種上的可行性。

本研究利用NTSYS-2.10e軟件的聚類分析功能，通過8對引物擴增的多態性條帶，將72個釀酒葡萄品種在遺傳相似系數為0.52左右時分為4個類群，簡單區分了個別遺傳關系較遠的品種，但這種方法不能將遺傳關系相近的品種單獨鑒定。本研究同時進行的基于SSR標記的MCID方法解決了這個問題，只用了6對引物構建了72個釀酒葡萄品種的MCID圖譜，快速、準確地進行鑒別。圖譜直觀顯示了整個鑒別過程，在葡萄品種一定的情況下，可以簡單明了找出各品種鑒定所需要的引物及其對應的特異性條帶長度。隨著葡萄新品種的培育以及種質資源調查的深入，需要鑒別的品種不斷增加，可以利用本研究所使用的6對引物進行多次PCR擴增，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型將其標注在MCID圖譜的相應位置上，即可獲得包含更多新品種的MCID圖。若現用引物無法鑒別新品種，則選用新引物再進行區分。

基于SSR標記的MCID法較其他分子標記鑒定方法有了較大突破，即利用盡可能少的引物擴增，根據不同引物所獲得的特異性譜帶依次鑒定出所有品種，操作簡便、目的性強，更適用于大量品種的快速鑒定。較好地解決了品種鑒定中各品種間親緣關系不清、品種繁雜無法區分的問題。對實現釀酒葡萄種質資源管理、苗木早期純度鑒定、促進釀酒葡萄品種的保護以及指導實際生產均具有重要意義。