凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法檢測飼料粗蛋白質含量的比較

梁世岳， 李海花， 陳龍賓， 陳麗麗， 李玉鵬， 楊鴻雁*

（1.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；2.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384）

粗蛋白質是飼料重要的營養成分之一，是畜禽生長發育必需的營養物質。蛋白質一般由碳、氫、氧、氮四種元素構成，其中氮是蛋白質中含量最穩定的元素，平均含量為16%，所以測定蛋白質含量通常只測定氮元素含量（張妍妍，2013）。畜牧行業采用由飼料中含有的氮元素含量乘以蛋白質轉化系數（常以6.25來表示）所得到的數據來推算飼料中蛋白質的含量，即通常所說的粗蛋白質。因此，飼料中粗蛋白質的檢測本質就是飼料中氮元素的檢測。目前，我國飼料粗蛋白質的國家標準檢測方法主要采用凱氏定氮法（李仲玉和杜娟，2017）。

凱氏定氮法是Kjeldahl于1883年提出的定氮方法（張清建，1995）。這種方法精確可靠，具有良好的精密度和重復性，設備成本較低，我國多采用此法。但是該方法操作步驟繁瑣,消耗時間長，對操作人員要求較高，測定結果受人為因素影響較大，操作中使用大量腐蝕性強酸、強堿，有一定的危險性，并且檢測過程會產生有毒有害氣體，既危害人體健康又造成環境污染。杜馬斯燃燒定氮法通過高溫燃燒將氮元素轉化為氮氧化合物進行定量，無需任何化學試劑，儀器自動進樣和計算結果，是一種快速、低成本、自動化高的定氮方法。本實驗采用凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法同時測定飼料樣品，對檢測方法和檢測結果進行比較分析，以期找到一種能準確、簡捷、快速、無污染測定飼料粗蛋白質含量的有效方法。

1 材料與方法

1.1 實驗原理

1.1.1 凱氏定氮法 催化劑條件下用濃硫酸高溫消煮，將飼料中的有機氮轉換為銨態氮并與硫酸結合為硫酸銨，通過強堿蒸餾來確定全氮含量（許超，2018）。 凱氏定氮法是一個氧化還原反應，把低價氮氧化并轉為氨鹽來測定，但不能把高價氮還原為氨鹽的形式，所以不能測出物質中所有價態的氮含量（周航等，2009），比如硝基氮和亞硝基氮，導致某些樣品的檢測結果偏低。

1.1.2 杜馬斯燃燒定氮法 樣品在900～1200℃純氧高溫下燃燒，產生的混合氣體中氮氧化物被全部還原成分子氮，被熱導檢測器檢測（范志影和劉慶生，2007），經獨立校正后自動計算出來，乘以相應的轉換系數即為粗蛋白質含量，每個樣品4～6 min即可完成（趙玉富，2013）。杜馬斯燃燒法能將樣品所含的有機氮和無機氮全部轉化成氮的氧化物后被還原劑還原成氮氣進行測定 （朱國霞和哈玲津，2017）。

1.2 實驗樣品 從河北和天津的飼料加工廠采集包括玉米、小麥、次粉、小麥麩、玉米DDGS、菜籽粕、大豆粕、苜蓿和魚粉等12份飼料原料作為檢測樣品，隨機編號樣品1～樣品12，用FOSS旋風磨粉碎至過40目篩，得到樣品量100 g左右，置于密封袋中備用。

1.3 儀器與設備 全自動凱氏定氮儀 （型號為FOSS 2300）；消化爐（型號為 FOSS 2040）；旋風磨（型號為CT 410），購自丹麥FOSS公司；杜馬斯燃燒定氮儀（型號為Rapid N），購自德國Elementar公司；分析天平 （型號為AE 100），購自瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.4 試劑與耗材 混合催化劑 (每片含3.5 g K2SO4及 0.4 g CuSO4·5H2O)， 購自丹麥 FOSS 公司；硫酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、硼酸（AR）、鹽酸（AR）、甲基紅（AR）、溴甲酚綠（AR），購自國藥集團化學試劑有限公司；氮氣(≥99.99%)、氧氣(≥99.999%)、氦氣(≥99.999%)，購自天津泰亞氣體銷售有限公司。

1.5 實驗設計 采用凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法同時對實驗樣品進行粗蛋白質含量測定，每個樣品分別做2個平行測定，粗蛋白質含量在25%以上時，允許相對偏差為1%；粗蛋白質含量在10%～25%時，允許相對偏差為2%；粗蛋白質含量在10%以下時，允許相對偏差為3%。否則，需重新稱樣測定，直至平行樣結果相對偏差符合要求為止，取平均值為測定結果。凱氏定氮法：每次消煮10個樣品，消煮時間約4 h，蒸餾時間約150 m，分2次完成。杜馬斯燃燒定氮法：每個樣品需4～6 min，一次性完成檢測，共需時間約2 h。

1.6 實驗步驟

1.6.1 凱氏定氮法 稱取樣品0.5 g左右，精確至0.0001 g，依據GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質測定方法》操作，全自動分析儀自動輸出檢測結果。

1.6.2 杜馬斯燃燒定氮法 稱取樣品0.25 g左右，精確至0.0001 g，置于錫箔紙中，擠出空氣、壓實，緊密包裹后置于自動落樣器，儀器自動進樣檢測并輸出結果。

1.7 數據的統計分析 采用Excel 2007對實驗數據進行初步整理，用SPSS 22.0統計軟件進行配對樣本T檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結果由表1可知，樣本粗蛋白質含量為7.88%～69.46%，跨越區間較大，代表性較強。兩組檢測結果的相對偏差基本都在2%以下，標準差都在0.60%以下，均符合國家標準《飼料中粗蛋白質測定方法》GB/T 6432-1994（國家技術監督局，1994）的要求。

2.2 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結果統計分析 由表2可知，兩組數據的差值為-0.86% ～0.29%、比值為98.76% ～101.10%，檢測結果基本一致；兩組數據經配對樣本t檢驗，P＞0.05，表明凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法對樣品的測定結果無明顯差異。

表1 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結果 %

表2 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結果的統計分析%

2.3 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法的比較

2.3.1 樣品要求比較 凱氏定氮法可以測定所有形態的樣品，固態樣品要求粉碎至過40目篩即可。杜馬斯燃燒法不能直接檢測液體樣品，對于復雜樣品分析難度較大，要求樣品是均勻粉末，由于稱樣量較小，樣品細度要求較高，一般過100目篩，以利于所稱樣品具有代表性。

2.3.2 稱樣量比較 凱氏定氮法稱樣量，一般以0.4～ 0.5 g為宜；杜馬斯燃燒法稱樣量為0.25 g以下，對于密度小體積較大的樣品，稱樣量應低于0.2 g，以確保其錫箔紙包，能順利進入樣品孔。凱氏定氮法對樣品的稱樣量要求相對寬松，而杜馬斯燃燒法要求較嚴格，由于進樣孔徑的限制，要求稱樣量與進樣孔徑相匹配，以免檢測失敗。

2.3.3 檢測時間比較 凱氏定氮法稱樣后需要消解和蒸餾步驟，一次可消解樣品10個左右，檢測過程需1～2 d；杜馬斯燃燒法稱樣后可直接進樣即時測定，每個樣品只需4～6 min就能得到檢測結果。

2.3.4 環境污染和安全性比較 凱氏定氮法檢測過程中使用濃酸、濃堿，產生大量含有化學污染物的廢氣、廢液，對人體和生態環境危害較大。杜馬斯燃燒法不使用化學藥品，且不會產生有毒有害的廢液、廢氣，安全性較高。

2.3.5 檢測人員比較 凱氏定氮法檢測人員需經過嚴格培訓和系統學習實驗室檢測知識，熟練掌握操作技能，整個檢測過程需檢測人員認真操作完成。杜馬斯燃燒法無需人員在場，儀器自動完成檢測過程。

2.3.6 檢測成本比較 凱氏定氮法使用大量化學試劑及玻璃器具，檢測過程需要保持冷凝水供給，電能和水源耗費較多。杜馬斯燃燒法不需化學試劑及器具，不需冷凝水，幾分鐘即可完成檢測，耗電少，檢測成本較低。

2.3.7 測定結果比較 表1和表2說明兩方法均具備良好的穩定性和重復性，且兩種檢測方法的檢測結果基本一致，經配對樣本t檢驗，P＞0.05，說明兩種檢測方法的檢測結果差異不顯著。

3 討論與結論

凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法測定結果的相對偏差都在2%以下；差值為-0.86%～0.29%；比值為98.76%～101.10%；經配對樣本t檢驗，P＞0.05；說明兩種方法均具有良好的穩定性和重復性且檢測結果差異不顯著，均能正確檢測樣品的粗蛋白質含量。

凱氏定氮法所用儀器價格低廉，即使在很小的實驗室也可以用簡單的凱氏定氮裝置實現蛋白質的測定，但檢測時間長，檢測成本高，工作量大，不適合大量樣品的檢測，檢測效率較低；檢測過程中常有試劑揮發，易對檢測人員身體造成傷害和環境污染。杜馬斯燃燒定氮法操作簡易方便，自動化程度高，大大縮短了檢測時間，無需化學試劑和冷凝水，降低了檢測成本，檢測效率較高；由于整個檢測過程沒有有毒有害物質產生，操作人員不用擔心化學試劑對身體的傷害，也減少了環境污染，安全性較高。因此，杜馬斯燃燒定氮法符合當前社會的需要，是值得推廣的一種粗蛋白質檢測方法。

由于實驗原理不同，凱氏定氮法只能測出部分硝態氮，對于含有硝酸鹽的樣品，測定結果影響較大，而杜馬斯燃燒法能夠將樣品中的氮元素完全檢測出來。以魚粉樣品為例，凱氏定氮法的測定結果比杜馬斯燃燒法低約1個百分點，杜馬斯燃燒法對樣品要求較高，不能檢測液態樣品，對于復雜樣品的分析效果欠佳，具有一定的局限性。杜馬斯定氮儀由于其較高的技術含量，儀器價格比較昂貴，從而限制了其在小型飼料廠的推廣應用。