一株貓爪草內(nèi)生真菌紅色素穩(wěn)定性研究

喬新榮，尹偉濤，蔣秋慧

(信陽農(nóng)林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000)

植物內(nèi)生真菌是指存在于健康植物根、莖、葉等組織部位內(nèi)部，不會對宿主植物造成明顯傷害或者引起宿主植物組織明顯病癥的真菌。藥用植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主植物相同、相似或全新的具有藥用價值的生物活性物質(zhì)[1]。目前，內(nèi)生真菌次生代謝物已成為尋找具有生物活性成分的一種重要來源。產(chǎn)于動、植物及微生物的天然色素與人工合成色素相比，因其安全無毒、色澤鮮艷、并具有營養(yǎng)及藥理活性等優(yōu)點，在食品行業(yè)廣受青睞，而微生物色素又因微生物生長周期短，便于人工控制生產(chǎn)等優(yōu)點，已成為天然色素來源的主力軍[2-5]。

自然界中能產(chǎn)生色素的微生物繁多，如真菌、酵母菌、細菌等，使用絲狀真菌，如曲霉作為食品著色劑的來源已歷史悠久[3]。但部分天然色素對光、熱、金屬離子、pH 等因素敏感而導致穩(wěn)定性較差，色價會隨著環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變[6]，這些因素直接決定了其應用范圍。因而，對色素穩(wěn)定性的研究具有非常重要的意義。藥用植物貓爪草(Radix ranunculi ternati)為毛茛科植物小毛茛(Ranunculus ternatus Thunb.)，入藥部位是貓爪草的塊根，其含有多糖、皂苷、黃酮類、生物堿類、氨基酸等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抑菌、抗結(jié)核、抗腫瘤等作用[7]。本文以從信陽地區(qū)貓爪草根中分離的一株產(chǎn)紅色素的內(nèi)生真菌為材料，對其產(chǎn)的紅色素穩(wěn)定性進行研究，為該色素進一步開發(fā)和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)紅色素的貓爪草內(nèi)生真菌S4，由信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院微生物實驗室分離，根據(jù)《真菌鑒定手冊》[8]初步鑒定為鐮刀菌(Fusarium sp.)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基，PDB 液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器及試劑 UV-6000紫外-可見分光光度計，數(shù)控超聲波發(fā)生器等儀器；甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、葡萄糖等試劑。

1.2 方法

1.2.1 紅色素溶解性分析 挑取PDA培養(yǎng)基上生長旺盛的內(nèi)生真菌S4菌絲，接種于含 250mLPDB培養(yǎng)液的500mL的三角瓶中，于28℃、150rpm 條件下培養(yǎng) 10d，離心，將發(fā)酵液和菌絲體分開，留取菌絲體。將濕菌絲用蒸餾水清洗后，濾去水分，稱取2g濕菌絲，以1:40(g:V)比例分別加入蒸餾水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及石油醚，超聲波提取30min, 離心，留上清液觀察顏色的變化。

1.2.2 紅色素光譜特征分析 取樣品測試液用 UV-6000 型分光光度計在 300～700 nm 范圍內(nèi)，間隔1nm進行掃描，記錄數(shù)據(jù)，利用Origin軟件繪圖，觀察其光譜特征，確定最大吸收峰值。

1.2.3 光對色素的影響 取色素樣品溶液，分別置于暗處、室外太陽光、室內(nèi)自然光、紫外光條件下處理2、4、8h，測定其在最大吸收波長處的吸光度值，并觀察光對色素顏色變化的影響。

1.2.4 溫度對色素的影響 取色素樣品溶液,分別置于4、25、50、100℃下，處理1、2、4h。冷卻至常溫后，測其在最大吸收波長處的吸光度值，并觀察色素溶液顏色的變化。

1.2.5 pH值對色素的影響 用2.5mmol/L的HCl和2.5mmol/L的NaOH 配制不同 pH 值 (1、3、5、7、9、11，13)的溶液，取5ml色素溶液，向其中分別滴加0.2mL不同 pH 值溶液，放置 4 h，測定其在最大吸收波長處的吸光度值并觀察色素顏色的變化。

1.2.6 金屬離子對色素的影響 配制2.5mmol/L的NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、FeSO4、CuSO4、MnSO4及ZnSO4溶液，各取0.2mL分別加入5ml色素溶液中，以加0.2ml去離子水為對照。充分溶解后，室溫下靜置4h。測定在最大吸收波長處的吸光度值并觀察色素顏色的變化。

1.2.7 氧化還原劑對色素穩(wěn)定性的影響 取5mL色素溶液，分別加入 0.2mL 濃度為5%的H2O2、5%的NaClO溶液、5%的Vc溶液以及0.2ml去離子水。室溫靜置4h，測定在最大吸收波長處的吸光度值并觀察色素顏色的變化。

1.2.8 常見添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 配制2.5mmol/L的葡萄糖、蔗糖及乳糖溶液，各取0.2mL分別加入5ml色素溶液中，以加0.2ml去離子水為對照。充分溶解后，室溫下靜置4h。測其在最大吸收波長處的吸光度值并觀察色素溶液顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅色素溶解性分析

從藥用植物貓爪草根中分離了一種產(chǎn)紅色素的內(nèi)生真菌鐮刀菌S4，菌落形態(tài)及產(chǎn)色素顏色如圖1，真菌菌落表面呈黃色，邊緣呈粉紫色，而背面產(chǎn)生大量的紅色素。將紅色素濕菌絲用蒸餾水清洗后，分別加入蒸餾水、甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯及石油醚，超聲波提取30min。過濾后觀察溶液顏色的變化(表1)，發(fā)現(xiàn)該色素易溶于丙酮。 因此后續(xù)試驗用丙酮提取液進行各項指標的測定。

圖1 菌落形態(tài)與提取色素

溶劑種類蒸餾水甲醇無水乙醇丙酮乙酸乙酯石油醚甲醇和丙酮混合物溶解性可溶可溶可溶易容微溶不容可溶溶解顏色紅色紅色紅色深紅色橘黃色無色紅色

2.2 產(chǎn)紅色素光譜特征分析

對菌株S4紅色素樣品進行300～700nm波長范圍內(nèi)，間隔1nm進行掃描，測定在波長515nm處有一最大吸收峰(圖2)。因此，測定515nm處色素光吸收值的變化進行該色素穩(wěn)定性的研究。

2.3 色素穩(wěn)定性研究結(jié)果分析

2.3.1 光對紅色素穩(wěn)定性的影響 由圖3可知，隨處理時間的延長，室外光、室內(nèi)光、紫外光及黑暗條件下色素樣品的吸光值無顯著變化，只有暗條件下略有增加。由此可知， S4菌株紅色素對光照不敏感，黑暗條件下有增色護色作用。觀察色素顏色也無明顯變化。

2.3.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 從圖4測得的吸光度可知，該色素在 4～100℃范圍內(nèi)溫度的變化對色素的穩(wěn)定性無太大影響，當50℃條件下，隨處理時間的延長，吸光度略增加，而100℃時，略下降，但無顯著變化。從觀察到的色素顏色也無明顯區(qū)別。由此表明，該色素耐熱性極好。

圖2 S4菌株紅色素吸收光譜 圖3光對色素穩(wěn)定性的影響

2.3.3 pH對色素穩(wěn)定性的影響 由圖5可看出，pH值小于7的酸性條件，色素吸光度偏低，觀察到色素顏色隨酸性的增強，呈橘紅色-橘黃色-淺黃色變化的趨勢。在堿性條件下，隨pH逐漸增加，吸光度增強，紅色色素逐漸加深。表明該色素對酸敏感，堿性條件下有增色護色效應。

圖4溫度對色素穩(wěn)定性的影響 圖5 ph對色素穩(wěn)定性的影響

2.3.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 由圖6可以看出，添加金屬離子Na+、Mn2+、K+后，與對照CK相比，其吸光度無明顯變化，觀察到色素顏色與對照比較，也無明顯變化，表明這些金屬離子對該色素無影響。添加金屬離子Ca2+、Fe2+后，吸光度略增加，紅色素提取液的紅色也略加深，表明其具有一定的增色作用。添加金屬離子Mg2+、Zn2+、Cu2+可使紅色色素溶液顏色變成橘黃色，表明紅色素提取液對Mg2+、Zn2+、Cu2+較敏感。

2.3.5 氧化還原劑對色素穩(wěn)定性的影響 由圖7可以看出 ，還原劑Vc和氧化劑H2O2的吸光值比對照小，觀察到紅色素的顏色也由紅色變?yōu)殚冱S色。但氧化劑NaClO溶液吸光值明顯增強，色素顏色也加深。進一步表明，NaClO作為堿性氧化劑，該色素在堿性條件下，可以避免氧化劑對色素的干擾，起到護色增色作用。

圖6金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 圖7氧化還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

2.3.6 常見添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 由圖8可以看出，添加葡萄糖后，吸光度值略升高，色素溶液顏色與對照相比，無明顯變化。添加蔗糖、乳糖后，其吸光度值略下降，色素溶液顏色也無顯著變化。由此表明，理論上，該色素對這三種常用食品添加劑較穩(wěn)定，該色素具有作為一般食品添加劑的潛力。

圖8常見食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

該色素對光、熱、堿、堿性氧化劑NaClO、金屬離子(Ca2+、Fe2+，Na+、Mn2+、K+)以及常見食品添加劑(葡萄糖、蔗糖、乳糖)較穩(wěn)定。對酸、Mg2+、Zn2+、 Cu2+、還原劑Vc及氧化劑H2O2較敏感。前期對菌株S4的抑菌活性進行了測定，結(jié)果表明該菌株有較強的抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及抗核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌 (Botrvtis cinerea)等病原菌的作用(未發(fā)表)。又因該菌是從藥用植物貓爪草中分離，貓爪草的多種生理活性賦予了與其共生的S4內(nèi)生真菌菌株具有一定的藥理應用潛力。下一步將從該真菌色素的抑菌[9]、抗氧化[10]、保健等生物活性方面進行深入研究，為其應用于食品添加劑、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面奠定基礎。