膠孢炭疽菌黑色素合成途徑中漆酶蛋白生物信息學分析

祝友朋 陳搖 韓長志

摘要：膠孢炭疽菌可以侵染桃、核桃等諸多重要農林植物，它可引起生產上諸多經濟樹種的炭疽病，嚴重威脅著各國農林業的健康生產。植物病原絲狀真菌中黑色素合成途徑中關鍵環節漆酶已經在稻瘟病菌、玉米大斑病菌等進行了較為深入的研究，然而尚未見有關膠孢炭疽菌黑色素合成途徑中關鍵環節漆酶的生物信息學分析報道。本研究以膠孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列為基礎，通過TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息學分析工具對上述序列開展蛋白質亞細胞定位、細胞信號肽、二級結構、錨定位點、保守結構域、跨膜結構域等進行分析，同時對上述序列開展與炭疽菌屬不同真菌遺傳進化關系分析。研究結果為進一步深入開展該蛋白在致病過程中所具有的功能研究打下堅實的理論基礎。

關鍵詞：農林植物;膠孢炭疽菌;黑色素;漆酶;生物信息學;遺傳進化

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiride）在分類上屬于炭疽菌屬真菌，作為引起多種農林業經濟作物炭疽病的病原菌之一，可以危害芒果、柿樹、草莓、桃樹以及核桃等植物[1]。前人研究較多關注于該菌的形態特征、生活史以及遺傳關系、致病基因等方面[2]。近些年，隨著同屬于炭疽菌屬中的禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）、希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum）全基因組序列的公布[3]，筆者對上述病菌G蛋白信號通路相關蛋白進行生物信息分析，同時，也對該菌中重要的G蛋白信號通路調控因子RGS蛋白開展生物信息學分析[4]。

植物病原絲狀真菌能否成功侵入寄主植物組織并在其中生長繁殖，是其能否成功導致植物發病的基本條件之一。DHN黑色素作為植物病原菌重要的毒力因子之一，其合成途徑包括1個聚酮體合成酶基因、2個還原酶基因、2個脫水酶基因以及1個漆酶基因[5]。漆酶作為一種廣泛存在于真菌、細菌、昆蟲和植物中含銅的多酚氧化酶，能夠催化酚類化合物及其衍生物，使之生成相應的苯醌和水[6]。目前，學術界關于漆酶在植物病原絲狀真菌中的報道較多，如稻瘟病菌[7]、灰霉菌[8]、玉米大斑病菌[9]、番茄枯萎病菌[10]等。漆酶基因與真菌的生長發育、分生孢子形成、黑色素合成、致病性等相關，但在不同植物病原真菌中的作用差異很大。就炭疽菌屬中真菌漆酶基因的研究而言，在西瓜炭疽病病菌（Colletotrichum orbiculare）中，漆酶基因1ac2調控附著胞黑色素和分生孢子色素沉著，突變后致病力喪失[11]。然而，漆酶基因lac1在黃瓜炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）中并非是黑色素合成和對寄主致病力的必要因素[12]。芒果膠孢炭疽菌漆酶基因lac1不僅可以調控降解芒果組織中的酚類物質、促進病原菌的擴展，也可以通過干擾與致病力相關的黑色素合成和細胞壁降解酶的產生來影響其致病力[13];推測1ac2可能調控分生孢子萌發，也可能參與調控其漆酶活性和抗氧化反應等[14]。

目前，對于C. gloeosporioides黑色素合成途徑中關鍵環節漆酶的生物信息學分析尚未見報道，近些年，隨著云南省各地區大面積種植核桃[15]，各地區核桃炭疽病發生較為嚴重（韓長志等，未發表數據），因此，深入開展該菌黑色素合成相關基因的研究，可以更好地明確病原菌的致病機制[16]，對于進一步深入開展該蛋白在致病過程中所具有的功能具有非常重要的理論指導和生產實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

根據西瓜炭疽菌中已經報道的漆酶蛋白LAC1、LAC2序列（蛋白編號為BAB32575、BAN13563.1）[11]，在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數據庫中進行BLASTp比對，獲得膠孢炭疽菌 Cg-14以及Nara gc5菌株的LAC1、LAC2蛋白序列，分別命名為Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質轉運肽及信號肽預測 利用TargetP 1.1 Server[17]和SignalP 4.0 Server[18]分別實現對蛋白質轉運肽的預測、信號肽的預測。

1.2.2 亞細胞定位及錨定位點分析 利用ProtComp v9.0和big-PI Fungal Predictor分別實現蛋白的定位[19]、錨定位點情況[20]。

1.2.3 蛋白質疏水性預測及理化性質分析 利用ExPASy[21]實現。

1.2.4 蛋白質保守結構域及跨膜結構域預測 利用SMART[22-23]實現對蛋白的保守結構域預測;利用TMHMM Server v.2.0[18]和HMMTOP version 2.0[24]、TMpred等跨膜網站對蛋白質的跨膜區結構進行預測。

1.2.5 二級結構預測 采用Phyre2在線分析實現[25]。

1.2.6 系統進化樹構建 在NCBI中找尋Cg14LAC1、Cg14LAC2的同源序列，利用ClustalX[26]進行多重比對分析，隨后利用MEGA 7.0軟件[27]構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 序列分析

通過對膠孢炭疽菌中Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2序列進一步分析，結果表明，Cg14LAC1比CgNLAC1序列多43個氨基酸，位置為第334～376氨基酸，推測可能原因在于測序結果不準確或者自然原因丟失，尚不能確定，而Cg14LAC2與CgNLAC2序列相同。為了更好地開展膠孢炭疽菌中漆酶蛋白的生物信息學分析，因此，本研究選擇Cg14LAC1、Cg14LAC2進行后續分析。

2.2 轉運肽、信號肽以及亞細胞定位、錨定位點預測

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2的信號肽分析，上述蛋白均具有明顯的信號肽序列，位置分別為第22、23位和第23、24位，最大切割率均為0.450，上述蛋白均屬于分泌蛋白;進一步對其轉運肽、亞細胞定位以及錨定位點進行分析，轉運肽分析結果表明，上述蛋白均定位在線粒體上，但其預測可靠性概率不同（表1），同時，亞細胞定位分析結果表明，上述蛋白定位于胞外，可結合在膜上（表2）;盡管如此，通過對上述蛋白進行錨定位點的預測分析，并未發現上述蛋白含有錨定位點。

2.3 疏水性及理化性質分析預測

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2進行疏水性預測，明確Cg14LAC1中位于第132位的蘇氨酸（T），其親水性最強（-3.267），而位于第16位的亮氨酸（L），疏水性最強（2.044）;與Cg14LAC1不同，Cg14LAC2中位于第375位的谷氨酰胺（Q），親水性最強（-2.889）;而位于第15位的亮氨酸（L），疏水性最強（2.489）（表3）。

一般而言，組成蛋白質的氨基酸種類可以分為酸性氨基酸、堿性氨基酸、非極性R基氨基酸以及不帶電荷的極性R基氨基酸等4類。對Cg14LAC1與Cg14LAC2氨基酸組成進行分析，明確上述蛋白在氨基酸組成方面，無論是數量，還是在所占比例方面均沒有太大的差別（表5）。

2.4 保守結構域及跨膜結構域分析

通過對Cg14LAC1與Cg14LAC2進行疏水性預測，明確上述蛋白均不含有保守的結構域;同時，利用HMMTOP以及TMHMM進行分析，上述蛋白均不具有跨膜區;進一步通過TMpred分析，發現Cg14LAC1具有2個跨膜區，Cg14LAC2具有1個跨膜區（表6），推測上述跨膜結構應為前期預測的信號肽更為準確。因此，膠孢炭疽菌中Cg14LAC1是否具有跨膜區域有待進一步通過生物學試驗進行驗證，而Cg14LAC2不具有跨膜區結構。

2.5 二級結構預測及組成情況分析

目前，預測蛋白質二級結構的常用方法除Phyre[28]和PSIPRED[29]外，還有PHD等方法。上述方法所得結果基本相似，本研究以Phyre所分析結果為例，明確膠孢炭疽菌中Cg14LAC1和Cg14LAC2蛋白含有α螺旋、無規則卷曲和β轉角、TM螺旋等結構（圖1），各結構所占比例大體相當。

2.6 遺傳關系分析

以Cg14LAC1、Cg14LAC2為基礎序列，通過BLASTp同源性搜索，獲得與膠孢炭疽菌漆酶具有同源性的炭疽菌屬不同真菌的氨基酸序列，根據其同源關系數值，結合Cg14LAC1、Cg14LAC2序列，利用MEGA 7.0進行系統進化分析，明確膠孢炭疽菌Cg14PLC1與Cg14PLC2分別形成具有不同群體的2類（數據未顯示），Cg14PLC1與膠孢炭疽菌中另外一個菌株Nara gc5中的CgNPLC1（XP_007283028.1）序列相同，與同屬于炭疽菌屬的其他真菌C. orbiculare中的ENH79795.1親緣關系較近;Cg14PLC2則與膠孢炭疽菌中的AFK76451.1親緣關系較近，并與菌株Nara gc5中的CgNPLC2（XP_007273654.1）聚為一類。

3 討論

前期，利用NCBI蛋白數據庫，對膠孢炭疽菌中漆酶蛋白進行“Colletotrichum gloeosporioides AND laccases”關鍵詞搜索，結果表明有57個蛋白，對上述蛋白逐一查看，去除西瓜炭疽菌中的漆酶蛋白，剩余46個蛋白，對這些蛋白開展遺傳關系分析，可以分為13個小類，該結果表明膠孢炭疽菌在不同炭疽菌屬種中的漆酶蛋白并不具有較強的保守性，該結果為進一步解釋膠孢炭疽菌可以侵染諸多農林植物提供新的研究思路。

同時，由于膠孢炭疽菌全基因組序列并未完全釋放，本研究根據同屬于炭疽菌屬的西瓜炭疽菌中已經報道的LAC1、LAC2進行BLASTp比對，從而獲得膠孢炭疽菌Cg-14、Nara gc5菌株中的LAC1、LAC2，并對其開展包括二級結構、疏水性、理化性質等全面的生物信息學分析預測工作，為進一步開展引起核桃炭疽病的炭疽病菌中漆酶的功能研究提供重要的理論參考。

膠孢炭疽菌是造成多種農林業上植物產生重要損失的病原菌之一[30-31]，它主要通過產生附著胞利用機械壓力穿透植物侵入寄主。黑色素是否合成直接關系到病原菌附著胞能夠形成巨大膨壓從而侵入寄主組織，因此，開展該病菌菌黑色素合成相關基因的研究對于進一步解析病原菌致病機制具有重要的理論意義，同時，也為進一步開發適合于今后生產上適用的靶標殺菌劑具有重要的應用價值。

4 結論

本研究以膠孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列為基礎，通過TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息學分析工具對上述序列開展蛋白質亞細胞定位、細胞信號肽、二級結構、錨定位點、保守結構域、跨膜結構域等分析，同時，對上述序列開展了與炭疽菌屬不同真菌遺傳進化關系分析。

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