高產和高生物活性的鐵皮石斛液體培養體系研究

張杰 許風國

摘要：通過對野生鐵皮石斛的定向誘導和逐步馴化，篩選適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖，并對其ITS（內轉錄間隔區）和Rbcl進行分子鑒定。在此基礎上，建立了適合鐵皮石斛原球莖快速生長的液體培養體系，對蛋白、多糖、醇浸出物、金屬含量等成分進行檢測分析。結果發現，以1/2MS+2.0 mg/L KT（激動素）+0.5 mg/L NAA（萘乙酸）+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物為鐵皮石斛原球莖液體培養基，經5周液體培養，采收原球莖（318.3±22.5） g/L（鮮質量），平均生長率為（9.7±0.59） g/（L·d）（鮮質量），單個最大鮮質量為23.7 g，多糖含量為（19.09±1.05）%，醇浸出物含量為（37.82±3.50）%，蛋白質含量為42.51%，其中精氨酸含量高達19.23 mg/g，鉛、鎘、砷、汞、銅等金屬含量遠低于最高限定標準。結果表明，采用該液體培養體系，可培育生產出高產和高生物活性的鐵皮石斛。

關鍵詞：鐵皮石斛;原球莖;液體培養;ITS; Rbcl

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）是一種珍稀中草藥，具有生津養胃、抗衰老、抗疲勞、降血糖、保肝護肝、抗腫瘤和增強免疫力等作用[1-4]。在自然環境條件下，野生鐵皮石斛對生存環境要求苛刻，種子萌發需要共生菌等作用[5]，加上毫無節制過度采集，野生鐵皮石斛已被列為瀕危物種[6]。目前廣泛采用傳統方式種植鐵皮石斛中草藥，但這種種植培育方式不僅需占用大量土地，培育周期長達3年，農藥殘留和重金屬污染普遍嚴重，不同種石斛混合種植時，易造成異花傳粉和雜交變種，而且種植使用大量無機化肥，易造成環境污染和品質下降等問題。為解決鐵皮石斛這種傳統珍稀中草藥種植所面臨的問題，培育品質純正、無污染、高生物產量和高生物活性的鐵皮石斛，本研究利用植物組織培養技術，建立了一種新型液體培養體系，培育生產高質量和高生物活性鐵皮石斛珍稀中草藥，可直接轉化到鐵皮石斛中試進行大規模商業化培育生產。

1 材料與方法

1.1 鐵皮石斛的定向誘導和液體培養體系

1.1.1 鐵皮石斛愈傷組織誘導 試驗于2015年在江蘇省蘇州市進行。以浙江雁蕩山野生鐵皮石斛莖段為外植體，消毒處理，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的固體瓊脂培養基上進行愈傷組織細胞誘導，培養溫度為 25 ℃，采用全光譜LED（發光二極管）燈，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.2 鐵皮石斛原球莖的誘導和液體懸浮馴化 以鐵皮石斛愈傷組織細胞為材料，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2%蔗糖的固體瓊脂培養基上定向誘導原球莖的產生。在1/2MS+2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭的固體瓊脂培養基上，可實現原球莖的快速生長增殖。將鐵皮石斛原球莖轉接到1/2MS+2%蔗糖液體培養基中，逐步懸浮馴化，篩選適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖新品系。培養環境條件均為25 ℃，采用全光譜LED燈，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.3 鐵皮石斛液體培養體系 將適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖新品系培育在1/2MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物的液體培養基中，將盛有液體培養基的三角瓶滅菌，于100 r/min懸浮液體培養，室溫25 ℃，光質5 ∶ 1 LED紅藍光，光照度 2 500 lx，光—暗周期12 h—12h，液體培養5周。

1.2 鐵皮石斛分子鑒定和系統進化分析

采用NCBI BLAST在線軟件對鐵皮石斛ITS和rbcL序列進行比對分析，并從NCBI下載相關ITS和rbcL序列用于構建系統樹。用MEGA 7.0構建鄰接系統樹，采用Clusta lW序列比對，系統樹自檢1 000次。

1.3 鐵皮石斛營養成分檢測和分析

1.3.1 多糖含量測定 鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗粉碎過100目篩，100 ℃熱水回流，浸提2 h，離心過濾，取上清。上清液直接采用二硝基水楊酸（DNS）法[9]測定總糖（C總糖）、還原糖（C還原糖）和多糖含量（C多糖）。

C多糖=C總糖-C還原糖。

（1）

以葡萄糖為標準品，制作測定標準曲線，為y=1.981x-0.092 5，r2=0.992。

1.3.2 醇浸出物含量測定 根據2015年版《中國藥典》醇溶性浸出物測定方法[10]，采用熱浸法測定鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗的醇浸出物含量。

1.3.3 氨基酸營養成分測定 根據國家食品氨基酸測定方法[11]，采用OPA/FMOC（鄰苯二醛/9-芴甲基氯甲酸甲酯）全自動柱前分析-AminoQuant氨基酸分析法測定鐵皮石斛原球莖氨基酸成分組成。

1.3.4 金屬元素含量測定 根據2010年版《中國藥典》元素檢測分析方法[12]，采用安捷倫電感耦合等離子體質譜儀（Agilent 7500ce ICP-MS）對鐵皮石斛原球莖進行元素含量的檢測分析。

1.4 數據統計和分析

采用Origin 8.0對試驗數據進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛的定向誘導和懸浮馴化

以野生鐵皮石斛莖段為材料，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的瓊脂固體培養基中，經45 d誘導培養，產生黃綠色顆粒狀愈傷組織（圖1-A）。將愈傷組織轉接到含有0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2% 蔗糖的1/2MS固體培養基上，經40 d誘導，會形成 6～8 mm 鐵皮石斛原球莖（PLB）。為實現原球莖在固體培養基上的快速生長，則可采用在1/2MS固體培養基中添加 2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭（圖2-B）的方法進行快速增殖培養。