HPLC同時(shí)測(cè)定咽炎片中4種指標(biāo)性成分的含量

李懷偉,馬昌豪,馮思騰,張 朋

(菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000)

咽炎片由玄參、百部、款冬花(制)、木蝴蝶、板藍(lán)根等12味藥材組成，為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)(中藥成方制劑)收載品種，臨床常用于慢性咽炎引起的咽干，咽癢，刺激性咳嗽等癥[1]。咽炎片藥材成分多，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)多通過(guò)薄層色譜和單一成分含量測(cè)定進(jìn)行質(zhì)量控制[1-5]，難度較大。通過(guò)同時(shí)測(cè)定多種成分的含量能更全面的反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量；本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定咽炎片中木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁的含量，能夠?yàn)檠恃灼|(zhì)量控制提供方法，保障用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；XS105 DualRange型十萬(wàn)分之一天平(METTLER TOLEDO)；FRQ-1006HT型超聲波清洗器(杭州法蘭特)。

1.2 藥品與試劑

甲醇、磷酸(色譜純，科密歐公司)；木蝴蝶苷B(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111915-201603)；黃芩苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111715-201720)；肉桂酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110786-201604)；蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201409)；咽炎片(市售，批號(hào)20180104，20180207，20180106)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁對(duì)照品各適量，分別加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷B0.2388 mg、黃芩苷0.1917 mg、肉桂酸0.0522 mg、蘆丁0.2078 mg的貯備液，再取貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷B23.88 μg、黃芩苷19.17 μg、肉桂酸5.22 μg、蘆丁20.78 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取約3.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足失重，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性溶液制備

按工藝方法制備缺木蝴蝶、玄參和款冬花(制)的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)[6-8]

色譜柱為Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，3 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，0.35%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～25 min，30%A；25～30 min,30%→43%A；30～50 min，43%A；50～51 min，43%→45%A；51～65 min，45%A；65～70 min，30%A)；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。理論板數(shù)以木蝴蝶苷B峰計(jì)應(yīng)不低于3000，目標(biāo)峰與相鄰峰分離度均大于1.5。

林語(yǔ)堂的“視讀者為知己”還體現(xiàn)在他譯創(chuàng)作品的一些細(xì)節(jié)之處。例如，《吾國(guó)吾民》（束君君2018:72）的正文開(kāi)頭寫(xiě)道：...for behind the creation of literature and the events of history there is always the individual who is after all of prime interest to us.其翻譯為“因?yàn)樵谖膶W(xué)創(chuàng)作和歷史事件的背后，總是那些單個(gè)的人使我們產(chǎn)生最大的興趣。”

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液，依“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁能較好的分離，峰形均良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表1 回歸方程及線性范圍

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁的RSD分別為0.17 %、1.02 %、0.68 %、0.33 %(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下于0，4，8，16，24，48 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁的RSD分別為0.69 %、1.25 %、0.86 %、1.05 %(n=6)，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取含有量已知(木蝴蝶苷B0.2753 mg·g-1、黃芩苷0.0850 mg·g-1、肉桂酸0.1002 mg·g-1、蘆丁0.2132 mg·g-1)的同一樣品適量，精密稱(chēng)取6份，每份1.5 g，精密加入等量的木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁對(duì)照品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁的平均回收率分別為99.39%、98.98%、98.99%、99.22%；RSD分別為0.49%、0.52%、1.17%、0.39%。

2.4 含量測(cè)定

取3批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算各組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

分別考察了甲醇-冰乙酸、乙腈-冰乙酸、甲醇-磷酸和乙腈-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇-0.35%磷酸分離效果較好。通過(guò)DAD檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)木蝴蝶苷B、黃芩苷、肉桂酸和蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)分別為276 nm、280 nm、285 nm、和257 nm，由于黃芩苷含量較低，而且在280 nm處4種成分波長(zhǎng)吸收都較好，因此選擇280 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于中成藥多數(shù)成分復(fù)雜，一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定幾種成分，不僅能夠節(jié)約成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥品質(zhì)量的全面控制。本研究中建立的方法可同時(shí)測(cè)定咽炎片中4種指標(biāo)性成分，方法簡(jiǎn)便高效，結(jié)果準(zhǔn)確；能夠反映出咽炎片中木蝴蝶、玄參和款冬花(制)的投料情況，為咽炎片的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考依據(jù)。