接骨膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

崔維剛，蔣勝岳，周利章，耿燕楠

(1.臨沂市行政審批服務(wù)局，山東 臨沂 276001；2.臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276001； 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

接骨膠囊為沂南攀峰骨科醫(yī)院生產(chǎn)品種，1999年7月起試行，制劑原名稱為“潘氏接骨靈膠囊(Ⅰ號(hào))”。該品種由桃仁、紅花、當(dāng)歸、土鱉蟲、骨碎補(bǔ)等21味中藥組成，在臨床上具有較好的療效。其功效主要為活血化瘀，續(xù)筋接骨。用于各種骨折、跌打損傷等。

目前，該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅包含4個(gè)顯微特征的鑒別以及血竭、當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別[1]。接骨膠囊作為臨沂市的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，具有比較好的臨床療效及銷量，但由于該處方涉及的中藥藥味數(shù)量較多，而中藥材來源、質(zhì)量差別較大，僅以現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)難以確保該制劑的質(zhì)量。因此，在當(dāng)前國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)大幅提高的前提下，我們對(duì)接骨膠囊進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，按照國(guó)家藥典藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，增加了紅花和梔子的薄層鑒別，以及柚皮苷的含量測(cè)定，增強(qiáng)了接骨膠囊質(zhì)量的穩(wěn)定性，為保證人民用藥安全提供進(jìn)一步的保障。

1 薄層色譜法對(duì)接骨膠囊中3種中藥成分進(jìn)行鑒別

1.1 儀器和試藥

XP205電子天平(METTLER TOLEDO)；硅膠G薄層板(10×20 cm，Merck KgaA，Germany)；KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；接骨膠囊(生產(chǎn)單位：沂南攀峰骨科醫(yī)院，批號(hào)：20131025，20131029，20131104)；梔子苷對(duì)照品(來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201316)；梔子對(duì)照藥材(來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120986-201399)；紅花對(duì)照藥材(來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120907-201111)；甲醇(德國(guó)默克生產(chǎn))為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 紅花的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物1.5 g，加丙酮∶水(80∶20)溶液5 mL，振搖15 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，加丙酮：水(80：20)溶液5 mL，振搖15 min，靜置，取上清液，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。展開系統(tǒng)的分離效果良好，結(jié)果見圖1。

1、11.紅花對(duì)照藥材；2～4.樣品20131025；5～7.樣品20131029；8～10.樣品20131104溫度：14℃，相對(duì)濕度：37%；薄層板：Merck KgaA硅膠G板圖1 紅花的薄層鑒別

1.2.2 梔子的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物1 g，加甲醇∶水(50∶50)溶液10 mL，超聲處理40 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取梔子對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取梔子苷對(duì)照品，加甲醇∶水(50∶50)溶液制成每1 mL含3 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液[2]。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱5 min。在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。展開系統(tǒng)的分離效果良好，結(jié)果見圖2。

1．梔子苷對(duì)照品；2.梔子對(duì)照藥材；3～5.樣品20131025；6～8.樣品20131029；9～11.樣品20131104溫度：17℃，相對(duì)濕度：34%；薄層板：Merck KgaA硅膠G板圖2 梔子的薄層鑒別

2 接骨膠囊中柚皮苷含量測(cè)定

接骨膠囊是由桃仁、紅花、骨碎補(bǔ)、土鱉蟲、牛膝等21味中藥組成，其中骨碎補(bǔ)具有療傷止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)骨功效[3]，在處方中對(duì)療效有比較大的貢獻(xiàn)，而柚皮苷為骨碎補(bǔ)和枳殼的共有成分，查閱文獻(xiàn)得知柚皮苷在此兩種藥材中含量較高[4]，因此選用柚皮苷作為該制劑的含量測(cè)定指標(biāo)。

2.1 儀器與試藥

安捷倫1260 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；DZK-D-4型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；XP205電子天平(METTLER TOLEDO)；接骨膠囊(沂南攀峰骨科醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20131025，20131029，20131104)；柚皮苷對(duì)照品(來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201312，含量以94.7%計(jì))；甲醇(德國(guó)默克生產(chǎn))均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：安捷倫SB-C18液相色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸(33∶67)；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算，應(yīng)不得低于3500。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷對(duì)照品(來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201312，含量以94.7%計(jì))12.25 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得(濃度為0.04640 mg/mL)。

2.4 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物(批號(hào)：20131025)適量，用研缽研細(xì)，稱取約1 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定其重量，水浴加熱回流1 h，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取2.3項(xiàng)下的柚皮苷對(duì)照品溶液(0.04640 mg/mL)2、4、6、8、10μL，注入安捷倫1260高效液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程：Y=1796.857X-2.7321，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.09280～0.4640 μg之間峰面積積分值和進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.6 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3項(xiàng)下的柚皮苷對(duì)照品溶液(0.04640 mg/mL)5μL，注入安捷倫1260高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定其峰面積。結(jié)果對(duì)照品峰面積積分均值為395.3，RSD值為0.22%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品內(nèi)容物(批號(hào)：20131025)適量，按照2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液。每隔4 h進(jìn)樣一次，每次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定，共進(jìn)樣7次，分別計(jì)算供試品溶液中柚皮苷的峰面積積分值。統(tǒng)計(jì)分析供試品中柚皮苷峰面積，積分均值為304.2，RSD值為0.97%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，滿足含量測(cè)定的需要。

2.8 方法重復(fù)性考察

取本品內(nèi)容物(批號(hào)：20131025)適量，照2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和上述供試品溶液各5 μL，注入安捷倫1260高效液相色譜儀，測(cè)定[5]。統(tǒng)計(jì)分析供試品中柚皮苷含量，平均值為0.530 mg/粒，RSD值為0.3%。結(jié)果表明含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)：20131025)適量，柚皮苷的含量為0.53 mg/粒，精密稱定，共取6份，每份中分別精密加入2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10 mL，按2.4項(xiàng)下的方法制成加標(biāo)供試品溶液，按2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 柚皮苷加樣回收率考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定方法的回收率良好。

2.10 專屬性試驗(yàn)

陰性對(duì)照溶液的制備：取處方中除去骨碎補(bǔ)、枳殼的其他19味藥，按處方比例制成陰性對(duì)照樣品，照2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

分別精密吸取2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、2.4項(xiàng)下的供試品溶液和上述陰性對(duì)照溶液各5 μL，注入安捷倫1260高效液相色譜儀，測(cè)定。分析發(fā)現(xiàn)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的位置上，有相對(duì)應(yīng)色譜峰，而陰性對(duì)照樣品色譜中無(wú)相對(duì)應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明處方中其他藥味對(duì)供試品中柚皮苷測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 RP-HPLC色譜圖

2.11 樣品測(cè)定

按2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，對(duì)收集到的3批樣品進(jìn)行提取制備，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 測(cè)定樣品中柚皮苷含量結(jié)果

3 討論

接骨膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，僅檢驗(yàn)顯微鑒別以及血竭、當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別，而從接骨膠囊的處方組成來看，共有21味中藥，現(xiàn)有的檢驗(yàn)項(xiàng)目，無(wú)法確保該制劑質(zhì)量的穩(wěn)定。因此，綜合考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性以及成本，增加紅花、梔子2個(gè)薄層色譜鑒別項(xiàng)目，以及柚皮苷成分的含量測(cè)定，在一定程度上確保了該制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)過程中，基于《中國(guó)藥典》2010年版一部骨碎補(bǔ)的含量測(cè)定方法，我們采用水浴加熱回流0.5 h、1 h、2 h的方法分別提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水浴回流0.5 h與1 h結(jié)果差異比較明顯，而水浴回流1 h與2 h結(jié)果無(wú)明顯差異。因此采用水浴回流1h作為含量測(cè)定提取工藝。