β-葡萄糖苷酶非水相生物合成紅景天苷

張 樂，沙久凱，陳宇彤，閆凱迪，王 華

(南京理工大學泰州科技學院 藥學院，江蘇 泰州 225300)

紅景天為景天科紅景天屬植物。我國應用紅景天很早，在藏醫《四部醫典》和《本草綱目》均有記載，紅景天是一種同人參等重要中藥材相媲美的高價值保健藥源，可入藥，也可做保健品[1]。近年來研究證明紅景天中主要有效成分紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用。

目前主要從植物體中提取獲得紅景天苷，但是植物體中的含量很低，雖然蘇波等[2]對紅景天苷提取工藝進行了優化，收率并不高，故人們開始探尋新方法以高效合成紅景天苷。另外還有利用化學方法合成和愈傷組織培養合成[3]。化學方法合成是以葡萄糖為主要原料合成、以對羥基苯甲醛或對羥基苯乙酸為主要原料合成、以對氨基苯乙醇或對羥基苯乙醇為主要原料合成。化學合成法具有收率和純度都很高、反應快速、成本低等優點，但大多合成路線需要對基團進行選擇性保護或使用昂貴的金屬催化劑，所用的一些催化劑和試劑易污染環境，而且其立體選擇性差。愈傷組織培養合成是以紅景天莖、葉及種子萌發的子葉等為外植體誘導而成的愈傷組織進而合成紅景天苷。酶法合成紅景天苷因具有選擇性高、產物純度較高、便于分離純化等優點而備受關注[4]。

本文在非水相介質中以β-葡萄糖苷酶催化逆水解反應合成紅景天苷，為高效制備紅景天苷提供新思路。

1 材料

1.1 試劑

β-葡萄糖苷酶，上海金穗生物科技有限公司；紅景天苷對照品(≥98% HPLC)，合肥博美生物科技有限責任公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

HH-W0-5L智控升降油浴；SHZ-DⅢ循環水式多用真空泵；WT10002K電子分析天平；SHA-B恒溫振蕩器；80-2臺式電動離心機；RE52C旋轉蒸發器；UV-2450紫外分光光度計。

2 實驗方法

2.1 酶促合成反應步驟

在25 mL具塞錐形瓶中，取酪醇、D-葡萄糖混溶于10 mL乙腈/緩沖液(pH值=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉18 g，冰醋酸9.8 mL，加水稀釋至1000 mL)，加入50 mg的β-葡萄糖苷酶粉，于40℃恒溫震蕩反應48 h。取反應液，用80-2臺式電動離心機離心20 min(轉速2000 r/min)，除去殘渣，得澄清溶液，向其中加入正丁醇約20 mL進行多次萃取，合并萃取液，旋蒸，得濃縮液，測定濃縮液體積，并通過分光光度法檢測其吸光度。

2.2 紅景天苷含量的測定

根據董彥莉等[5]對紅景天中所含紅景天苷含量測定方法的研究中選擇紫外分光光度法，選定的檢測波長為230 nm。以吸光值為縱坐標，以紅景天苷濃度為橫坐標，作紅景天苷標準曲線(見圖1)。

圖1 紅景天苷的紫外吸光度標準曲線Fig.1 Standard curve of ultraviolet absorbance of salidroside

3 催化條件的優化

3.1 單因素實驗

3.1.1 酪醇濃度對紅景天苷合成的影響

在葡萄糖的濃度為2.5%，40℃，80%乙腈反應體系中，搖床酶促反應48 h，研究酪醇濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%時，對紅景天苷合成的影響，見圖2。

圖2 酪醇濃度對紅景天苷合成的影響Fig.2 Effect of tyrosol concentration on salidroside synthesis

從圖2可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著酪醇濃度的不斷增加，紅景天苷的轉化率也不斷增加，當酪醇起始濃度為8%時，紅景天苷的轉化率最大，而后又開始下降。分析可知，底物濃度過大，在一定條件下抑制了β-葡萄糖苷酶的催化活性，使酶活下降，從而使紅景天苷產率降低。

3.1.2 葡萄糖濃度對紅景天苷合成的影響

在酪醇的濃度為8%，40℃，80%乙腈反應體系中，搖床酶促反應48 h，研究葡萄糖濃度分別為1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%時，對紅景天苷合成的影響，見圖3。

圖3 葡萄糖濃度對紅景天苷合成的影響Fig.3 Effect of slucose concentration on salidroside synthesis

從圖3可以看出，在其它條件不變的條件下，紅景天苷的轉化率隨當葡萄糖濃度先增加后又降低，在葡糖糖濃度為2.5%時取得最大值。分析可知，這可能是因為葡萄糖濃度過高，在80%乙腈反應體系中未完全溶解，另外還有底物抑制效應，使得紅景天苷轉化率降低。

3.1.3 反應時間對紅景天苷合成的影響

圖4 反應時間對紅景天苷合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on salidroside synthesis

在葡萄糖濃度為2.5%，酪醇的濃度為8%，40℃，80%乙腈反應體系中，搖床酶促反應48 h，研究反應時間分別為12、24、48、72、96、120 h時，對紅景天苷合成的影響，見圖4。

從圖4可以看出，在其它條件不變的條件下，在12～72 h內紅景天苷的轉化率率隨著時間的延長而增加，到達72 h時紅景天苷的轉化率率達到最大值。但是當時間超過72 h后，紅景天苷的轉化率率有所下降。分析可知，可能是由于時間的延長，紅景天苷提取液中的其他無效成分的溶出，從而影響了有效成分之紅景天苷的釋放，同時，β-葡萄糖苷酶在有機溶劑中時間過長導致酶活性降低從而使轉化率降低[6]。

3.1.4 乙腈濃度對紅景天苷合成的影響

在葡萄糖的濃度為2.5%，酪醇濃度為8%，40℃，搖床酶促反應48 h，研究乙腈濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%時，對紅景天苷合成的影響，見圖5。

圖5 乙腈濃度對紅景天苷合成的影響Fig.5 Effect of acetonitrile concentration on synthesis of salidroside

從圖5可以看出，在其它條件不變的條件下，隨著乙腈濃度增加，轉化率增加，直至乙腈濃度達到80%，轉化率最高，接著開始降低。分析可知，因為水分過多，產物極易發生水解反應[7]，所以紅景天苷的轉化率較低，而在適當濃度的有機溶劑中，水解反應會受到一定的抑制，所以轉化率較高。

3.2 正交試驗

根據單因素實驗結果，針對酪醇濃度、葡萄糖濃度、乙腈濃度、反應時間四個因素，確定如表1的L9(43)的正交試驗。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Table of factors and levels for orthogonal test

實驗結果如表2所示。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表2(續)

從表2對紅景天苷轉化率的極差分析來看，四個因素對紅景天苷轉化率影響水平的強弱為A>B>C>D，即轉化率的最大影響因素為葡萄糖濃度，最小的影響因素是反應時間；最佳水平組合為A1B2C2D2，即實驗2，轉化率最高，為16.98%。

3.3 驗證實驗

為了進一步確認最佳優化組合A1B2C2D2是否能夠達到預期目標，對其進行驗證性試驗，此時，紅景天苷的轉化率分別為16.34%、15.93%、17.01%，平均轉化率為16.43%，該結果顯示紅景天苷的轉化率較高且較穩定。通過該驗證試驗可以進一步的說明該種提取工藝可以達到預期的目標。

4 結論

本文在單因素試驗的基礎上，應用正交試驗研究了各單因素之間的相互影響，優化了合成紅景天苷的工藝，并確定了最佳的工藝參數：酪醇濃度8%，葡萄糖濃度2.5%，乙腈濃度為80%，40℃下反應72 h，此時紅景天苷的轉化率為16.43%。與Hiroyuki Akita等[8]提取的β-葡萄糖苷酶催化合成紅景天苷的產量相比，其產率為11%，本文優化的工藝條件下，酶法合成紅景天苷的產率得到了較大幅度的提高，可促進實現綠色、高效制備紅景天苷的目標。