槐耳清膏負(fù)性調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)抑制裸鼠胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移效果觀察

湯加寧 謝華夏 張?jiān)X 徐志遠(yuǎn) 程向東

槐耳作為一種藥用真菌，在我國已使用千年，隨著科技的發(fā)展，其藥用價(jià)值及抗腫瘤機(jī)制不斷被我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)。國內(nèi)學(xué)者研究表明槐耳真菌的熱水提取物槐耳清膏（主要活性物質(zhì)為蛋白多糖）具有誘導(dǎo)胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等數(shù)種癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用[1-3]。本研究采用胃腺癌MKN-45細(xì)胞系構(gòu)建裸鼠足墊胃癌移植瘤模型，予槐耳清膏灌胃治療，觀察足墊移植瘤的生長(zhǎng)及腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，通過檢測(cè)和比較足墊胃癌組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的蛋白和mRNA表達(dá)情況，進(jìn)而探討槐耳清膏抑制胃癌MKN-45細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 FBS、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒（AllPrepDNA/RNA/Protein Mini Kit）購自德國QIAGEN公司，熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司，qRT-PCR引物序列購自上海生工生物工程股份有限公司，抗體βactin購自武漢谷歌生物公司，抗體MMP-9購自美國Affinity公司，槐耳清膏購自啟東蓋天力藥業(yè)有限公司。倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司，電泳儀、蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，Real-time qPCR儀器購自美國Applied Biosystems公司。槐耳清膏灌注液的配制方法：將槐耳清膏溶解于0.9%氯化鈉溶液中配成濃度為200mg/ml的灌洗液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后于4℃儲(chǔ)存待用。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物 人胃腺癌細(xì)胞株系MKN-45由南京凱基生物科技有限公司提供。40只4~6周齡雄性BALB/c裸鼠由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)。

1.3 足墊胃癌移植瘤模型 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃腺癌細(xì)胞系MKN-45制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/ml。每只裸鼠右下肢足墊接種上述細(xì)胞懸液50μl，觀察人胃腺癌MKN-45細(xì)胞在裸鼠足墊生長(zhǎng)和成瘤情況。

1.4 給藥及處理 建模成功后將裸鼠按體重配對(duì)法分成槐耳清膏組與氯化鈉溶液組，每組20只?；倍甯嘟M灌胃槐耳清膏液25ml/kg，2d 1次，氯化鈉溶液組每只小鼠均灌胃氯化鈉溶液0.5ml，2d 1次。灌胃給藥前測(cè)量裸鼠體重。給藥5周時(shí)再次測(cè)量體重后采用頸椎脫臼法處死兩組裸鼠。

1.5 觀察和檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般狀態(tài)觀察 建模成功后每日觀察兩組裸鼠活動(dòng)度、進(jìn)食和足墊腫瘤變化情況，每2d測(cè)量1次體重。

1.5.2 裸鼠足墊腫瘤相對(duì)體積（RTV）測(cè)算 在脫頸處死并解剖兩組裸鼠后，參考公式RTV=πxyz/6（x為腫瘤長(zhǎng)度，y為腫瘤寬度，z為腫瘤厚度），測(cè)算兩組裸鼠足墊腫瘤的RTV。

1.5.3 裸鼠組織病理學(xué)分析 裸鼠處死后，解剖兩組足墊腫瘤及相應(yīng)腘窩淋巴結(jié)，固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，根據(jù)有腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移只數(shù)/建模成功只數(shù)計(jì)算腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

1.5.4 MMP-9蛋白、mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit試劑盒提取足墊胃癌組織總蛋白和總RNA。采用Western blot法檢測(cè)兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，比較MMP-9蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。通過qRTPCR檢測(cè)兩組裸鼠足墊胃癌組織中的MMP-9 mRNA表達(dá)。使用紫外分光儀分析RNA純度和濃度。根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)所有樣品RNA，反應(yīng)條件：42℃ 45min，70℃ 10min。將 cDNA 儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中備用。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，MMP-9的前引物序列為GCAATGCTGATGGGAAACCC，后引物序列為AGAAGCCGAAGAGCTTGTCC，β-actin的前引物序列為TCACCATGGATGATGATATCGC，后引物序列為 GACGGTTGGATCTGCCATGA。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30s；PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃ 5s；60℃ 34s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)qRT-PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線。根據(jù)相對(duì)定量分析方法計(jì)算MMP-9mRNA在槐耳清膏組中相對(duì)于氯化鈉溶液組中的擴(kuò)增異倍數(shù)為2-ΔΔCt。其中Ct值表示目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct（MMP-9）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（槐耳清膏組）-ΔCt（氯化鈉溶液組）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠一般狀態(tài)比較 兩組裸鼠在造模后及實(shí)驗(yàn)期間均未出現(xiàn)死亡，槐耳清膏組與氯化鈉溶液組裸鼠在體重和食欲上比較無明顯差別，槐耳清膏組裸鼠活躍度明顯比氯化鈉溶液組高。

2.2 兩組裸鼠足墊腫瘤RTV 兩組裸鼠足墊腫瘤為灰紅色不規(guī)則圓形腫塊，槐耳清膏組、氯化鈉溶液組裸鼠足墊腫瘤 RTV 分別為（1611.85±611.83）mm3、（662.75±450.66）mm3，槐耳清膏組大于氯化鈉溶液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.80，P＜0.05）。

2.3 兩組裸鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較 槐耳清膏組裸鼠中有8只裸鼠出現(xiàn)腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（40.0%）；氯化鈉溶液組裸鼠中有15只出現(xiàn)腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（75.0%）?；倍甯嘟M轉(zhuǎn)移率小于氯化鈉溶液組轉(zhuǎn)移率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.01，P＜0.05）。

2.4 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達(dá)比較槐耳清膏組足墊胃癌組織MMP-9蛋白的表達(dá)水平低于氯化鈉溶液組（圖1）；氯化鈉溶液組灰度值比（MMP-9/β-actin）為 0.97±0.01，槐耳清膏組為 0.74±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.03，P＜0.05）。

2.5 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9 mRNA表達(dá)比較槐耳清膏組足墊胃癌組織MMP-9 mRNA的ΔCt值為18.70±1.81，而氯化鈉溶液組的為 15.31±1.10，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且計(jì)算求得 2-ΔΔCt=0.095，故MMP-9 mRNA在槐耳清膏組的表達(dá)量為氯化鈉溶液組的9.5%。

圖1 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第4大主因[4]。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是嚴(yán)重影響患者預(yù)后的因素（其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的主要途徑之一），因此如何抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是當(dāng)今腫瘤治療的熱點(diǎn)。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與多種信號(hào)通路及分子密切相關(guān)，其中MMP-9在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移之中起到重要的作用。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、Ⅳ型膠原蛋白，從而破壞細(xì)胞間的天然屏障，降低細(xì)胞粘附力，增強(qiáng)其遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜向外侵襲、轉(zhuǎn)移[5]。國內(nèi)外研究表明MMP-9與胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為高度相關(guān)[6-10]。Jonsson等[11]提出MMP-9可以作為生物標(biāo)物來預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)。鄭春雷等[12]研究表明胃癌患者的臨床組織標(biāo)本中MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度和臨床分期密切相關(guān)。筆者團(tuán)隊(duì)先前體外實(shí)驗(yàn)表明，槐耳清膏有阻滯細(xì)胞周期，抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[13]，另本團(tuán)隊(duì)前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明槐耳清膏可調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路降低MMP-9 mRNA表達(dá)抑制胃癌腹膜轉(zhuǎn)移[1]。本研究是基于使用胃腺癌細(xì)胞系MKN-45構(gòu)建裸鼠足墊胃癌移植瘤模型，并用槐耳清膏灌胃治療，觀察足墊腫瘤的生長(zhǎng)及腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，并檢測(cè)和比較足墊腫瘤細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)情況，進(jìn)一步為槐耳清膏在體內(nèi)的抗腫瘤機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，構(gòu)建足墊胃癌移植瘤模型成功率為100%，試驗(yàn)期間裸鼠均未出現(xiàn)死亡?；倍甯嘟M裸鼠的足墊腫瘤RTV明顯小于氯化鈉溶液組，可見槐耳清膏能顯著抑制MKN-45胃癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，與本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[13]。槐耳清膏組裸鼠的腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于氯化鈉溶液組，從轉(zhuǎn)移率上講槐耳清膏具有抑制胃癌細(xì)胞MKN-45淋巴轉(zhuǎn)移的作用。MMP-9具有降解ECM的作用，降低細(xì)胞黏附力，增強(qiáng)其遷移能力，與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為此本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步檢測(cè)了槐耳清膏組與氯化鈉溶液組裸鼠足墊胃癌組織的MMP表達(dá)情況。通過對(duì)比，筆者發(fā)現(xiàn)槐耳清膏組裸鼠胃癌組織中MMP-9表達(dá)（mRNA水平及蛋白水平）均明顯低于氯化鈉溶液組。就此本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為槐耳清膏具有下調(diào)MMP-9表達(dá)的作用,這與本團(tuán)隊(duì)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[1]。

綜上所述，筆者認(rèn)為槐耳清膏是一種潛在的抗腫瘤藥物，對(duì)于胃癌的生長(zhǎng)和淋巴轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用，其抑制淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是通過負(fù)性調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤ECM的降解，增加腫瘤細(xì)胞黏附能力，抑制腫瘤細(xì)胞向外侵襲轉(zhuǎn)移。