大黃素增強索拉菲尼抗肝癌治療作用的機制研究

王清清 張浩 曹浩強 俞清江

大黃素（Emodin,Emo）是從大黃、何首烏、虎杖等中藥中提取出的一種蒽醌類單體化合物，具有抗癌（包括肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤）的藥理學作用，同時對肝、腎有保護作用[1]。上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）參與腫瘤細胞的侵襲和轉移的生物學過程，也是腫瘤耐藥機制之一[2]。在先前的研究中本團隊發現肝癌索拉菲尼（sorafenib,Sora）耐藥細胞具有更強的耐藥性及遷移和轉移能力[3]，本研究將進一步探討Emo是否能增強Sora抑制人肝癌Sora耐藥細胞的活性和遷移能力及其機制，為提高Sora抗肝癌治療的臨床療效提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人肝癌細胞HepG2和Huh7均購自上海中國科學院細胞庫；Emo（批號：PRF8021741，純度≥98%）購自成都普瑞法科技開發有限公司；Sora購自德國Bayer公司；FBS購自美國Gibico公司；藥物細胞毒性實驗（CCK8法）試劑盒購自日本Dojindo Laboratories公司；Western blot實驗采用美國Bio-Rad電泳儀，試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；一抗兔抗人N-cadherin、Vimenti、GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Teclnology公司；二抗兔抗羊購自杭州聯科生物技術股份有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；化學發光成像系統購自美國Syngene公司。

1.2 細胞培養與肝癌Sora耐藥細胞株的構建 將人肝癌親本細胞株Huh7和HepG2置于含10%FBS的高糖培養基（DMEM）中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，取處于對數生長期的細胞用于實驗操作；Huh7R和HepG2R是經體外2μM的Sora低濃度開始誘導，持續1~2個月，逐步增加Sora藥物處理濃度，直至達到細胞的最大藥物耐受濃度所制成的耐藥細胞，總誘導周期約6個月。

1.3 肝癌Sora耐藥細胞的分組 根據處理因素的不同將兩種肝癌Sora耐藥細胞株分別分為對照組、Sora組、Emo組、Sora+Emo組，對照組不加入任何藥物，Sora組加入濃度為2μM的Sora，Emo組分別加入濃度為25、30μM 的 Emo，Sora+Emo 組分別加入 2μM Sora、25μM Emo及 2μM Sora、30μM Emo。

1.4 細胞活性檢測 采用CCK8法。取生長狀態良好，處于對數生長期的人肝癌細胞，胰酶消化后用含5%FBS培養基重懸細胞（5×104/ml）后接種到96孔培養板中孵育過夜，丟棄舊培養液。先檢測Sora半數抑制濃度（IC50）：Huh7、HepG2 和 Huh7R、HepG2R 細胞中加入不同濃度的 Sora（0、1、2、4、6、8、10、12μM），根據細胞存活率結果，應用GraphPad Prism5軟件計算各組對Sora的IC50；再將在含5%FBS的培養基中繼續培養48h的各實驗組細胞除去培養液，每孔加入CCK8試劑與DMEM 1∶9混合液 100μl，置于 37℃孵箱中繼續孵育 1~2h。使用酶標儀在450nm波長下測定液體的吸光度（A）值。每個實驗組設置3個復孔，實驗重復3次，取平均數。細胞存活率計算公式如下：細胞存活率（%）=[實驗組（OD）-空白組（OD）]/[對照組（OD）-空白組（OD）]×100%。

1.5 細胞克隆形成能力檢測 采用集落形成實驗。將人肝癌Sora耐藥細胞按照300個/孔的濃度接種到6孔板中。24h后，Sora組、Emo組、Sora+Emo組用含不同濃度藥物的10%FBS培養液替換舊培養液，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養10d。當細胞集落形成肉眼可見的克隆時，終止實驗，丟棄舊培養液，甲醇固定20min，0.01%結晶紫染色20min，用相機拍照后計數細胞克隆數。

1.6 細胞遷移能力檢測 采用Transwell遷移實驗。取對數生長期的肝癌HepG2R和Huh7R細胞，用胰酶消化后用PBS清洗3次，用含2%FBS的DMEM培養液重懸細胞并計數；取 200μl細胞懸液（5×104個細胞/100μl）鋪于小室上層，下室加入含不同濃度藥物的20%FBS培養液；48h后取出Transwll小室，棄去小室中的培養液，預冷的PBS清洗3遍后用預冷的甲醇固定20min，0.01%結晶紫染色20min；PBS清洗小室，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，顯微鏡下隨機挑選5個視野（×200），計數穿膜遷移的細胞數，取平均值。

1.7 EMT相關蛋白N-cadherin和Vimenti表達檢測采用Western blot法，各實驗組細胞經藥物處理48h后，用預冷的PBS清洗3次，加入預先配制好的蛋白裂解混合液（RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑=100∶1）在冰上裂解30min；收集的細胞裂解液于4℃、12 000g/min離心15min，按照BCA定量說明書對上清液定量；加入5×loading buffer上樣緩沖液，于100℃蛋白煮沸變10min；每實驗組加入20~30μg蛋白，選擇10%分離膠進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠）電泳，在100V電壓及100min的濕轉條件下將蛋白轉至NC膜（硝酸纖維素膜）上，然后用含5%脫脂奶粉的封閉液于室溫下孵育2h；加入相應的一抗稀釋液（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，PBST緩沖液漂洗3次×15min，二抗稀釋液（1∶1 000）室溫孵育 2h，PBST 漂洗 3 次×15min；ECL發光液顯影，化學發光成像系統采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計算目標蛋白相對表達量。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌親本細胞和Sora耐藥細胞的IC50比較 Huh7的 IC50為 3.8±0.4，HepG2 為 3.5±0.3，Huh7R 為 5.6±0.8，HepG2R為9.0±1.1。HepG2R和Huh7R的IC50均明顯高于HepG2和Huh7，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.2 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞存活率比較 Sora+Emo組的細胞存活率均明顯低于對照組、Sora組及Emo組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表1。

2.3 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的克隆形成數目比較 Sora+Emo組的克隆形成個數明顯低于對照組、Sora組及Emo組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見圖 1、表 2。

表1 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的存活率比較（%）

2.4 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的遷移數目比較 Sora+Emo組的細胞遷移個數明顯低于對照組、Sora組及Emo組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見圖 2（見插頁）、表 3。

圖1 Emo和Sora抑制肝癌Sora耐藥細胞的克隆形成

表2 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的克隆形成數目比較（個）

2.5 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的蛋白相對表達量比較 Sora+Emo組的間質標志物N-cadherin、Vimenti蛋白表達下降，相對蛋白表達量明顯低于對照組、Sora組及Emo組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見圖 3、表 4。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居全球第2位[4]。手術切除是治療早期肝癌的首選方法，但是往往很多患者發現時已是晚期，失去了根治性切除的機會。Sora是唯一被美國食品藥品監督管理局批準用于治療晚期肝癌的一線分子靶向藥物，能有效抑制RAF/MEK/ERK介導的細胞信號傳導通路而直接抑制腫瘤細胞的增殖，還可通過抑制血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR）和血小板衍生生長因子（PDGF）受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細胞的生長，但是只能夠延長患者3個月的生存期[5]。一些學者通過體外實驗研究發現長時間的Sora刺激可導致肝癌細胞對其產生耐藥性[3，9]?？梢奡ora的長期應用容易產生獲得性耐藥，限制了其臨床療效。因此，探索肝癌Sora耐藥機制已成為當前研究的熱點。

表3 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的遷移數目比較（個）

圖3 Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的蛋白電泳圖

表4 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細胞的蛋白相對表達量比較

Emo是中藥大黃的有效成分之一，通過調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲相關基因來抑制腫瘤的生長和轉移。Kim等[6]的研究提出Emo能夠通過抑制膽固醇代謝來增強Sora對肝癌細胞的抗腫瘤活性，同時也有學者通過體外實驗研究提出Emo不僅能夠抑制肝癌的生長，而且對小鼠肝、腎功能無明顯影響，預示著Emo是一種的安全、有效的藥物[7]。因此，目前研究認為Emo能作為腫瘤聯合化療的輔助用藥。

國內外相關研究表明，EMT是腫瘤生長和侵襲的分子機制之一，其特點表現為上皮細胞失去基底側極性和細胞間的黏附力，間葉細胞獲得更強的侵襲和轉移能力的生物學過程，被認為與腫瘤的侵襲及轉移相關[8]。van Malenstein等[9]研究提出肝癌Sora耐藥細胞發生EMT，而且具有更強的遷移和侵襲能力。在本研究團隊先前的實驗中已證實肝癌Sora耐藥模型發生EMT[3]。同時，一些學者提出腫瘤細胞的EMT對細胞毒性藥物和分子靶向藥物的耐藥性起著關鍵作用，其中包括肝癌Sora耐藥[10-11]；因此，靶向EMT為研究切入點，是逆轉腫瘤細胞耐藥、提高臨床療效的新型研究方向。本研究通過長期低濃度Sora誘導成功構建人肝癌Sora耐藥細胞模型，發現Emo聯合低濃度Sora能夠有效抑制其增殖及克隆形成，較單一藥物處理具有更強的抗腫瘤活性；同時，Emo聯合低濃度Sora作用人肝癌Sora耐藥細胞，與單一藥物處理組相比，細胞遷移數明顯下降，提示聯合用藥能顯著抑制耐藥細胞的遷移。通過深入研究顯示，聯合用藥能夠明顯抑制上皮標記蛋白N-cadherin、Vimenti的表達，證實Emo聯合低濃度Sora對耐藥細胞的增殖抑制、遷移抑制與EMT相關。

當然，本研究也有一定局限性，沒有構建相對應的動物實驗模型，但是從目前的研究中本研究團隊總結如下：（1）Emo聯合低濃度Sora能夠增強Sora的藥物敏感性，增強其抗腫瘤活性；（2）Emo聯合低濃度Sora能夠抑制耐藥細胞的遷移；（3）Emo可能通過抑制EMT來影響其生物學行為。