Foxp3和CD8+T細胞在乳腺癌組織中的表達及與預后的關系

付媛媛 徐錦波 張敏 陳述政 程雪

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，并且是女性腫瘤患者死亡的主要原因。隨著對乳腺癌發生發展機制的深入研究，腫瘤免疫微環境已成為研究熱點問題之一。免疫微環境在腫瘤的發生、發展和患者的預后中都起到決定性的作用。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte,TILs）主要反映局部免疫反應，在腫瘤進展過程中起了至關重要的作用[1]。CD8+T細胞介導Ⅰ型免疫反應，可增強CD8+和CD4+T細胞的積聚，促進其抗腫瘤作用[2]。在乳腺癌中，腫瘤浸潤性CD8+T細胞與患者生存期[3]和對治療的反應密切相關[4]。調節性T細胞

（regulatory T cell，Tregs）是T淋巴細胞的亞家族之一，也被稱之為抑制性T淋巴細胞。叉頭狀轉錄因子p3（forkhead box protein3，Foxp3） 是 CD4+CD25+Tregs的特異性生物標志，其在腫瘤免疫中也發揮了重要作用[5]。本研究采用免疫組化法評估乳腺癌組織中Foxp3陽性Tregs和CD8+T細胞的表達情況，分析其與乳腺癌患者臨床病理因素及預后的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2013年12月在本院乳腺外科住院并行手術治療的患者78例，均為女性，術后病理檢查確診為浸潤性導管癌，年齡28~81（52.2±20.3）歲；排除標準：術前采用過任何形式的化療患者。收集患者腫瘤大小、淋巴結轉移情況、腫瘤分期、分化程度及其他臨床病理資料，臨床分期采用TNM國際分期標準。根據2013年St.Gallen乳腺癌國際會議上規定的乳腺癌分子分型分類標準[6]，將乳腺癌分為5類：Luminal A、Luminal B（HER-2 陰性）、Luminal B（HER-2陽性）、HER-2過表達及Base-like（三陰）型。患者術后均接受以紫杉類（包括紫杉醇、多西他賽）和（或）蒽環類（包括表柔比星、吡柔比星、多柔比星）為基礎的化療，每3周為1個療程，整個治療時間有4~8個周期。人類表皮生長因子受體2（HER-2）陽性患者均聯合使用曲妥珠單抗靶向治療。

1.2 主要試劑 一抗選用兔抗人Anti-Foxp3 antibody[SP97]（ab99963）、小鼠抗人Anti-CD8 antibody（ab59480）均購自英國ABcam公司；即用型快捷免疫組化試劑盒（Maixin Reagent）購自福州邁新生物技術有限公司；二氨基聯苯胺（3,3-diaminobenzidine,DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 Foxp3與CD8+表達的檢測 采用免疫組化法。10%甲醛溶液固定標本，常規石蠟包埋后連續切取6~8張4μm薄片，分別置于陽離子防脫片后脫蠟、水合，然后用檸檬酸鹽緩沖液修復Foxp3和CD8，將玻片完全浸沒于3%雙氧水中，避光室溫孵育10min。血清封閉，分別向玻片滴加稀釋后的一抗 Foxp3（1∶100）及CD8（1∶100），放在保濕盒內后置 4℃冰箱孵育，第 2 天取出保濕盒，并在常規沖洗后用二抗37℃孵育30min。DAB染色后，再用蘇木素染色胞核1~2min，分化后再次溫水返藍15～30s，最后置于顯微鏡下觀察染色及分化程度。梯度乙醇脫水，并用中性樹膠封片后保存。光學顯微鏡下（×400）觀察拍照。Foxp3在細胞核中呈棕色或棕褐色為陽性表達，CD8在細胞膜呈棕色或棕褐色為陽性表達。陽性細胞計數方法如下[7]：在顯微鏡下隨機選取10個高倍視野（×400），采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化切片目標區域進行掃描，并行密度分析，得到陽性細胞百分比（目標區域陽性細胞個數/總細胞個數）。

1.4 觀察指標及隨訪 觀察并記錄患者的年齡（以40歲為分界[8]）、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結轉移情況、分化程度、是否存在癌栓、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2、分子分型情況。所有患者手術治療后均以門診復診及電話方式進行隨訪，隨訪截至時間為2018年10月，78例患者隨訪時間為22~106個月，中位隨訪時間90個月，死亡和失訪共21例，復發4例，記錄中位無病生存期（DFS）。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。呈正態分布的計量資料以表示，不呈正態分布的計量資料以中位數表示；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank檢驗；采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化切片結果。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Foxp3和CD8+在乳腺癌組織中的表達情況 Foxp3表達陽性細胞百分比為（31.12±6.23）%，以 Foxp3陽性細胞＞31%為Foxp3高表達組，≤31%為Foxp3低表達組；CD8表達陽性細胞百分比為（39.24±15.22）%，以 CD8+細胞＞39%為CD8+高表達組，≤39%為CD8+低表達組。Foxp3和CD8+高、低表達結果見圖1（見插頁）。

2.2 乳腺癌組織Foxp3、CD8+表達與臨床病理因素的關系 乳腺癌組織中，Foxp3高表達組與Foxp3低表達組比較，兩組患者在腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結陽性、分化程度、是否存在癌栓及分子分型方面比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；CD8+高表達組與CD8+低表達組比較，兩組患者在腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結陽性、分化程度及是否存在癌栓方面比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2的表達與Foxp3、CD8+的表達均無明顯相關性（均P＞0.05），見表 1。

2.3 Foxp3、CD8+表達與DFS的關系 Foxp3高表達組患者的中位DFS為85個月，Foxp3低表達組患者的中位DFS為99個月，差異有統計學意義（χ2=5.687，P＜0.05）；CD8+高表達組患者的中位DFS為99個月，CD8+低表達組患者的中位DFS為80個月，差異無統計學意義（χ2=0.180，P＞0.05），見圖 2、3。

2.4 不同Foxp3、CD8+表達組合亞組DFS的比較 根據Foxp3和CD8+的表達水平，進一步將患者分為4個亞組：Foxp3高表達CD8+高表達組（16例）、Foxp3高表達CD8+低表達組（28例）、Foxp3低表達CD8+高表達組（9例）、Foxp3低表達 CD8+低表達組（25例），結果顯示Foxp3高表達CD8+低表達組患者中位DFS是56.5個月，雖然低于Foxp3高表達CD8+高表達組（99.5個月）、Foxp3低表達CD8+低表達組（99個月）及Foxp3低表達CD8+高表達組（90個月），但差異無統計學意義（χ2=7.708，P＞0.05），見圖 4。

3 討論

乳腺癌患者存在免疫缺陷已被多項研究證實，且乳腺癌組織中有大量免疫細胞浸潤[9-10]。研究表明，乳腺癌組織中細胞毒性淋巴細胞浸潤提示預后良好[11]，TILs數量與預后呈正相關[12]。然而，也有一些研究表明，TILs數量與患者總生存期呈負相關[13]。其中，Foxp3在腫瘤發生、發展、侵襲、轉移等方面發揮重要作用[14-15]，而腫瘤浸潤性CD8+T細胞與術后生存時間[15]及對治療的反應方面有著緊密聯系[16]。TILs對預后的影響取決于浸潤細胞的類型、功能狀態、腫瘤組織中浸潤細胞的定位及其與腫瘤細胞的相互作用。

圖2 Foxp3高表達與Foxp3低表達組的DFS曲線

圖4 Foxp3高表達CD8+高表達、Foxp3高表達CD8+低表達、Foxp3低表達CD8+高表達、Foxp3低表達CD8+低表達組的DFS曲線

Foxp3是Tregs細胞的相對特異性生物標志。Tregs可以抑制其他免疫細胞的活性，維持免疫系統的穩定性，并可能在抑制腫瘤特異性免疫過程中起重要作用。乳腺癌組織和外周血中均存在大量的Tregs[17]，但是Foxp3并不能完全代表Tregs細胞[18]。既往研究發現，Tregs的過表達[19]與乳腺癌的發生及預后[20]相關。通過對乳腺癌腫瘤標本采用免疫組織化學檢測發現，原位癌患者中Foxp3陽性細胞數明顯增多的患者其復發風險較高。DFS和總生存期在浸潤性癌Foxp3陽性細胞顯著增加的患者中也相對較短[17]。上述研究表明，乳腺癌患者中，Foxp3高表達意味著較差的預后。然而，一項關于ER陰性乳腺癌的研究表明，Foxp3高表達的基底樣乳腺癌患者中有更長的DFS[21]。因此，目前關于Foxp3在乳腺癌中預后的研究結果并不一致。本研究中，Foxp3細胞浸潤與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結轉移、分化程度、否存在癌栓以及分子分型等方面相關，提示預后不良。這進一步證實了既往研究結論[17]。進一步生存分析顯示，Foxp3低表達組患者的中位DFS明顯高于Foxp3高表達組，也進一步證實了Foxp3與患者預后生存時間呈負相關。

圖3 CD8+高表達與CD8+低表達組的DFS曲線

腫瘤微環境中的TILs主要是CD8+T細胞，既往研究表明CD8+腫瘤淋巴細胞浸潤意味著預后較好[22-24]。然而，也有研究表明CD8+在不同的乳腺癌亞型中有不同的結果和預后。例如，有研究就提出乳腺癌患者的CD8+細胞的數量與存活率無關。然而，在另外一項基底樣乳腺癌中，其結果卻是CD8+預示有更好的預后[25]。因此，許多以前的大規模研究對CD8+與生存之間的關系有不同的結論。在本研究中，CD8+浸潤情況與腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移及是否存在癌栓等有關，并且與提示預后較差的淋巴結轉移、存在癌栓等因素呈負相關。在隨后的亞組分析中也顯示，Foxp3低表達組的患者中位DFS顯著長于Foxp3高表達組。進一步分析發現，Foxp3低表達CD8+高表達亞組有著最佳的預后，明顯優于其他3組，但差異無統計學意義。筆者認為，由于本研究中病例數較少，而且在本研究中Foxp3可能來源于不同的T細胞，從而導致其免疫狀態不同，因此其對預后的影響尚不明確。

總之，檢測乳腺癌患者的免疫狀態有助于預測乳腺癌患者的預后。患者的免疫狀態、腫瘤的臨床特征、病理類型、治療方法等因素決定了乳腺癌患者的預后。因此，對乳腺癌患者免疫狀況進行更深入的研究將有助于臨床醫生為乳腺癌患者選擇更具針對性的個性化治療方案。本研究與國際先進水平仍存在一定的差距，期待在接下來的研究中能夠進一步擴大樣本量，研究更多免疫指標對患者預后的影響，從而使更多患者受益。