牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的特性及初步分離

花榜清，吳正鈞

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436）

牛類芽孢桿菌BD3526是從西藏地區(qū)牦牛乳中分離出的一種新的菌株，前期研究發(fā)現(xiàn)，其能產(chǎn)生胞外多糖[1]，且該胞外多糖能刺激脾臟細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表達，具有作為天然免疫調(diào)節(jié)劑的潛力[2-3]。同時，其還能產(chǎn)生凝乳酶[4]，其產(chǎn)生的凝乳酶活力是商業(yè)米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）來源凝乳酶的1.33 倍[5]。除此之外，牛類芽孢桿菌BD3526還能產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有良好的降糖效果[6]。大鼠體外實驗表明，牛類芽孢桿菌BD3526的發(fā)酵產(chǎn)物能降低大鼠腸黏液中的炎癥因子水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，改善2型糖尿病癥狀[7]。牛類芽孢桿菌BD3526的發(fā)酵上清液還能促進乳品中常用植物乳桿菌ST III的生長和凝乳[8]，該菌株在人工消化液環(huán)境中具有良好的存活能力，且不具有溶血作用，具有作為益生菌應(yīng)用的潛力[9]，對食品開發(fā)具有重要意義。

臨床抗生素的耐藥性問題一直是人類面臨的難題之一[10]，微生物抗菌肽（microbial antimicrobial peptides，AMP）作為一種新型的抗菌物質(zhì)，與傳統(tǒng)的抗生素相比，對多種細(xì)菌感染有效，被認(rèn)為是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞入侵的第一道防線，來自芽孢桿菌的AMP是克服目前無效抗生素的候選物質(zhì)之一[11-13]。劉玉娟等[14]發(fā)現(xiàn)，生長在TYC培養(yǎng)基上的牛類芽孢桿菌BD3526菌體通過丙酮浸提后能得到具有抗菌活性的物質(zhì)，進一步提高了牛類芽孢桿菌BD3526的開發(fā)及利用價值。關(guān)于牛類芽孢桿菌BD3526產(chǎn)抗菌物質(zhì)的研究，在其麩皮發(fā)酵液中分離出2 種抗菌物質(zhì)，分別為殺鐮孢菌素LI-F04a和一種新的抗菌物質(zhì)Bovisin，Bovisin是LI-F04a的衍生物，其在胍基上比LI-F04a多了-(CH2)2-結(jié)構(gòu)，且其與LI-F04a均具有熱穩(wěn)定性好、耐酸堿的特性[15]。本研究主要探討牛類芽孢桿菌BD3526在新培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的初步分離及特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉（含54.5%乳糖、32.9%蛋白質(zhì)、0.9%脂肪、7.9%礦物質(zhì)和3.8%水分） 新西蘭恒天然公司。

營養(yǎng)瓊脂 上海盛思生化科技有限公司；酵母抽提物 上海拜力生物科技有限公司；葡萄糖、淀粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鈉、無水乙醇、甲醇（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Sephadex LH-20凝膠柱 美國GE Healthcare公司。

供試菌為牛類芽孢桿菌BD3526（Paenibacillus bovisBD3526），指示菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CGMCC1.879、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CGMCC1.1848、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）CGMCC1.9136、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC63501、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922和沙門氏菌（Salmonella）ATCC13076，以上菌株均來自乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室。

牛類芽孢桿菌生長培養(yǎng)基（含脫脂乳粉40 g/L、瓊脂12 g/L）、牛類芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基（含脫脂乳粉40 g/L）、牛類芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（含葡萄糖20 g/L、淀粉20 g/L、硫酸銨20 g/L、酵母提取物10 g/L、磷酸氫二鉀2.6 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.25 g/L）、指示菌生長培養(yǎng)基（含牛肉膏1 g/L、酵母膏2 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L） 自制。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TH-CB-402超凈工作臺 美國Labconco公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；TE612-L電子天平 美國Sartorius公司；Avanti J-301高效離心機、AVANTI J30I高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter有限公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機德國Heraeus公司；Micro 17R微量臺式離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；5417R小型冷凍離心機德國Eppendorf公司；Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國Heidolph公司；DHL-A恒流泵、BSA-100B自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

供試菌株的培養(yǎng)：將菌株劃線接種于脫脂乳瓊脂平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

指示菌株的培養(yǎng)：將菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 發(fā)酵種子液的制備

在脫脂乳瓊脂平板上挑取牛類芽孢桿菌BD3526單菌落，接種到20 mL脫脂乳液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h，即得發(fā)酵種子液。

1.3.3 發(fā)酵液的制備

取發(fā)酵種子液，以體積分?jǐn)?shù)3.0%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，即得發(fā)酵液。利用牛津杯法測定抗菌物質(zhì)的活性，平板計數(shù)法測定活菌數(shù)量。

1.3.4 最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用2 倍稀釋法稀釋待測樣品，在指示菌平板上滴加10 μL稀釋后的樣品，觀察抑菌圈出現(xiàn)情況。能抑制指示菌生長的最小質(zhì)量濃度即為該樣品的MIC。

1.3.5 熱穩(wěn)定性的測定

分別取1 mL發(fā)酵液，于120 000 r/min條件下離心5 min，去除菌體和沉淀，取上清液分別置于50、60、70、80、90 ℃水浴中保溫1 h，沸水浴30 min，121 ℃條件下處理15 min，取100 μL經(jīng)熱處理后的樣品，以未經(jīng)熱處理的樣品作對照，檢測抗菌活性。每組實驗平行測定3 次，取平均值。

1.3.6 pH適用范圍的測定

分別取1 mL發(fā)酵液，于120 000 r/min條件下離心5 min，取上清液，分別調(diào)節(jié)pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10，取100 μL處理后的樣品，以未經(jīng)處理的樣品作對照，檢測抗菌活性。每組實驗平行測定3 次，取平均值。

1.3.7 酶敏感性的測定

分別取1 mL發(fā)酵液，于120 000 r/min條件下離心5 min；分別稱取4 mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶，分別溶解在20 mmol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖溶液中，將pH值調(diào)節(jié)至各酶的最適pH值（胰蛋白酶最適pH值7.8～8.5，胃蛋白酶最適pH值2.0～3.0，蛋白酶K最適pH值7.2～7.5，鏈霉蛋白酶最適pH值7.8～8.0），使其最終質(zhì)量濃度為8 mg/mL；將各酶溶液分別與發(fā)酵上清液混合，使各酶最終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，將混合液在37 ℃水浴中保溫3 h，取100 μL經(jīng)酶處理后的樣品，以加入同體積的磷酸鹽緩沖溶液樣品作為對照，檢測抗菌活性。每組實驗平行測定3 次，取平均值。

1.3.8 粗提物的制備

將發(fā)酵液于120 000 r/min條件下離心5 min，取上清液50 mL，加入同體積的無水乙醇，4 ℃條件下靜置12 h，于120 000 r/min條件下離心5 min，上清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至體積為5 mL。

1.3.9 Sephadex LH-20凝膠柱層析

使用Sephadex LH-20凝膠柱層析，體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液作為流動相，以4 倍柱體積的流動相沖洗柱子，待柱子平衡后，加入2%柱床體積的樣品，進行洗脫，流速設(shè)定為4.0 mL/min，每2 min收集1 管，共收集2 個柱體積的樣品。使用點種法測定各管樣品的抗菌活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵過程中的生長曲線

圖 1 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵過程中抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生情況Fig. 1 Production of antimicrobial substances by Paenibacillus bovis BD3526 during fermentation

測定牛類芽孢桿菌BD3526在組合培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h的菌落總數(shù)和抗菌物質(zhì)產(chǎn)生情況。由圖1可知，牛類芽孢桿菌BD3526在3 h后開始進入對數(shù)生長期，24 h左右進入穩(wěn)定期，其活菌數(shù)在穩(wěn)定期能達到9.30 （lg（CFU/mL））（即2.36×109CFU/mL），與其在麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線類似[16]。牛類芽孢桿菌BD3526在發(fā)酵15 h時檢測到抗菌活性，隨著發(fā)酵時間的延長，其抗菌活性逐漸增強，48 h時的抑菌圈直徑為20.24 mm，抗菌活性達到最大，隨后抗菌活性緩慢減弱。牛類芽孢桿菌BD3526可能為了對其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進行自我免疫，分泌了一種胞外免疫原性蛋白酶作為防御[17-18]。而前期研究中，牛類芽孢桿菌BD3526在麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基中生長時，72 h抗菌活性達到最大[16]。因此，后續(xù)實驗主要探究牛類芽孢桿菌BD3526在組合發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的特性。

2.2 牛類芽孢桿菌BD3526產(chǎn)抗菌物質(zhì)的MIC

分別選取4 株革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌CGMCC1.879、藤黃微球菌CGMCC1.1848、單增李斯特菌CGMCC1.9136及枯草芽孢桿菌ATCC63501）和2 株革蘭氏陰性菌（大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC13076）作為指示菌株，通過測定發(fā)酵上清液的MIC來確定牛類芽孢桿菌BD3526在組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生物質(zhì)的抗菌特性。

表 1 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液對不同菌株的MICTable 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 against different strains

由表1可知，牛類芽孢桿菌BD3526在組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在較高質(zhì)量濃度時對指示菌株中的革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用，對革蘭氏陰性菌則沒有明顯的抑制作用。牛類芽孢桿菌BD3526對金黃色葡萄球菌CGMCC1.879、藤黃微球菌CGMCC1.1848的MIC均為10.00 mg/mL，對單增李斯特菌CGMCC1.9136、枯草芽孢桿菌ATCC63501的MIC均為20.00 mg/mL。

2.3 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

圖 2 不同溫度熱處理后牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液的抗菌活性Fig. 2 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 after different heat treatments

牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度熱處理，由圖2可知，牛類芽孢桿菌BD3526在該組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在經(jīng)過高溫121 ℃、15 min處理后依舊保持較好的活性，表明牛類芽孢桿菌BD3526在該組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性，更有利于后期的開發(fā)利用。

2.4 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中抗菌物質(zhì)的pH值適用范圍

圖 3 不同pH值條件下牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液的抗菌活性Fig. 3 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 at different pH values

由圖3可知，牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中抗菌物質(zhì)的抗菌活性在pH值2～10范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。在人類所食用的食物中，有些食物pH值低至3左右[19]，正常人體胃液pH值為0.9～1.8[20]，抗菌物質(zhì)耐酸堿的特性為其應(yīng)用提供了更大的可能性。

2.5 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中抗菌物質(zhì)的酶敏感性

圖 4 不同酶處理后牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液的抗菌活性Fig. 4 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 after being digested by different enzymes

由圖4可知，牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中的抗菌物質(zhì)在經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K處理后，其抗菌活性未發(fā)生明顯變化，而經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后，抗菌活性明顯下降。鏈霉蛋白酶是自灰色鏈霉菌中分離的非特異性蛋白水解酶，能作用于肽鍵間的氨基酸，表明牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液中的抗菌物質(zhì)可能存在肽類物質(zhì)。

2.6 牛類芽孢桿菌BD3526抗菌物質(zhì)的初步分離純化

選取體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液進行等度洗脫，測定每管洗脫液的抑菌活性。由圖5可知，第21～24、28～31管洗脫液具有抗菌活性，表明牛類芽孢桿菌BD3526在該組合培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生了至少2 種不同的抗菌物質(zhì)，這與牛類芽孢桿菌BD3526麩皮發(fā)酵液初步分離純化的結(jié)果有所不同[15]。

圖 5 牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析后的洗脫曲線Fig. 5 Elution curve of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 purified from Sephadex LH-20 gel column chromatography

3 結(jié) 論

使用組合培養(yǎng)基作為牛類芽孢桿菌BD3526的發(fā)酵培養(yǎng)基，其發(fā)酵上清液對指示菌株中的革蘭氏陽性菌有明顯的抗菌作用，該發(fā)酵上清液具有良好的熱穩(wěn)定性、耐酸堿，經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后活性明顯下降，表明發(fā)酵液中含有肽類抗菌物質(zhì)。采用Sephadex LH-20凝膠柱層析獲得初步純化的樣品，經(jīng)過對洗脫液的活性檢測發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵上清液至少含有2 種抗菌活性物質(zhì)，根據(jù)抗菌物質(zhì)在凝膠柱上保留時間的不同，初步判定牛類芽孢桿菌BD3526在該組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生了與前期在麩皮發(fā)酵液中不同的抗菌物質(zhì)。關(guān)于該組合培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)只做了初步分離，后期還需對其進行進一步純化，并進行結(jié)構(gòu)鑒定以及實際應(yīng)用方面的研究，從而為食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域帶來新的突破。