雙歧桿菌抗氧化肽的分離鑒定

王世博，張金蘭，李平蘭*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物體有氧呼吸的副產物[1]，包括含氧自由基、氧離子和過氧化物[2]。在生物體內，最主要的ROS來源是線粒體呼吸鏈產生的超氧陰離子[3-4]。ROS具有較強的化學活性[5]，在生物體內積累的ROS能夠造成DNA、蛋白質和脂質的氧化損傷，導致細胞和組織受損[6]，造成氧化壓力，促進慢性疾病的發展，如動脈粥樣硬化、糖尿病、心臟病等[7-10]。

抗氧化肽正在逐漸作為食品成分被接受。在功能性食品和營養品中補充抗氧化肽，可以緩解人體內的氧化應激，降低氧化壓力[11]。目前，研究人員在乳制品和發酵乳中均發現了具有抗氧化能力的生物活性肽：劉志東等[12]在牛乳中發現抗氧化活性肽HIR；Mao Xueying等[13]發現，通過蛋白酶將牦牛乳酪蛋白降解為肽，可以表現出較強的自由基清除活性；Li等[14]在山羊乳酪蛋白酶解物中分離出5 種具有抗氧化活性的寡肽（VYPF、FGGMAH、FPYCAP、YVPEPF、YPPYETY）；Piovesana等[15]在驢乳中篩選出抗氧化肽TKTEEGEFISEGGGVR；Chang等[16]在發酵乳制品中分離出2 種抗氧化肽（VLSLSQSKVLPVPQK和VLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQA）。這些乳制品中的抗氧化肽一些來自于乳中酪蛋白的水解，一些由發酵過程中的微生物產生。

已有研究表明，動物雙歧桿菌可以表現出較強的抗氧化能力[17-18]。動物雙歧桿菌乳亞種B013（Bifidobacterium animalissubsp. lactisB013）由本實驗室分離自廣西巴馬長壽老人腸道，前期工作表明，該菌株有較強的抗氧化活性，同時菌株培養物上清液表現出較強的自由基清除能力[19]。本研究的目的是從菌株的培養物上清液中分離純化抗氧化活性物質，并對活性物質進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：動物雙歧桿菌乳亞種B013（Bifidobacterium animalissubsp. lactisB013）由中國農業大學應用微生物研究室保藏。

MRS肉湯培養基（生化試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司；抗氧化劑檢測試劑盒、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶 美國Sigma公司；DMEM高糖培養基 美國Corning公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4） 北京酷來搏科技有限公司；氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）國藥集團化學試劑（北京）有限公司；乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；三氟乙酸（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶K 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；SCL-1300垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；GB303電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Legend Micro 17臺式高速離心機、Q Exactive串聯質譜儀美國Thermo Scientific公司；MQD-S3R恒溫培養箱上海晏泉儀器有限公司；Synergy HT多功能酶標儀 美國BioTek公司；TM-100恒溫混勻儀 合肥艾本森科學儀器有限公司；LNG-T98冷凍離心濃縮干燥器 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化能力測定

參照Rizzello[20]、G?kbulut[21]等的方法，使用抗氧化劑檢測試劑盒進行測定。反應體系中加入10 μL樣品和20 μL肌紅蛋白工作液，再加入150 μL 2,2’-聯氮雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）工作液，反應5 min，加入100 μL停止液（1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉水溶液），測定405 nm波長處的吸光度（A405nm）。分別采用濃度為0、0.015、0.045、0.105、0.210、0.420 mmol/L的Trolox（水溶性VE，6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸，C14H18O4）溶液作為樣品繪制標準曲線，通過將樣品的A405nm帶入回歸方程將樣品的抗氧化能力換算成Trolox當量抗氧化能力（mmol Trolox/L）。

1.3.2 抗氧化活性培養物上清液培養體系的選擇

分別取培養24 h的動物雙歧桿菌乳亞種B013菌液1 mL，10 000 r/min離心2 min；棄去上清，用生理鹽水洗滌3 次去除殘余的培養基，分別加入1 mL DMEM培養液、1 mL含1 g/100 mL葡萄糖（pH 7.2～7.4）的0.01 mol/L PBS、1 mL含1 g/100 mL葡萄糖的生理鹽水和1 mL 1 g/100 mL的葡萄糖水溶液，反復振蕩，制成600 nm波長處光密度（optical density，OD600nm）為0.5的菌懸液；置于厭氧培養盒中，加入厭氧產氣袋，37 ℃培養24 h，培養結束后10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 抗氧化活性培養物上清液培養體系響應面優化試驗

參照孫鵬等[22]的方法，進行Box-Behnken試驗設計[23]。選取的因素和水平分別為：菌量（以OD600nm表示）：0.25、0.50、0.75；培養時間：24、18、12 h；葡萄糖添加量：1%、3%、5%。以上清液的總抗氧化能力作為響應值。達到培養時間后，10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 抗氧化活性成分分析

按照響應面優化得到的培養體系制備活菌培養物上清液，進行如下處理[24-25]：取1 mL培養物上清液，不進行其他處理，作為對照組備用；取1 mL培養物上清液，100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫備用；取1 mL培養物上清液，加入10 μL蛋白酶K溶液，37 ℃處理30 min；取1 mL培養物上清液，加入10 μLβ-葡萄糖苷酶和10 μL纖維素酶，50 ℃處理4 h；最后分別測定每個處理組的總抗氧化活性。

1.3.5 培養物上清液中肽粗品的制備

按照響應面優化得到的培養體系制備培養物上清液100 mL，10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，-20 ℃冷凍24 h，真空凍干48 h，加入10 mL去離子水，反復振蕩使凍干樣品溶解，將樣品放入透析袋中，4 ℃透析6 h，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.6 固相萃取

使用C18固相萃取小柱（容量6 mL，柱床容量500 mg），首先向小柱中加入純乙腈活化柱床；待乙腈流盡后加入含0.1%三氟乙酸（tri fluoroacetic acid，TFA）的超純水平衡柱床；取5 mL肽粗品加入5 μL TFA混勻，加入小柱；待樣品流盡后加入含0.1% TFA的超純水洗滌柱床，并重復2 次；依次用0%、20%、40%、60%、80%乙腈水溶液沖洗柱床，收集流出液，并分別測定抗氧化活性。

1.3.7 超濾

取固相萃取后抗氧化活性最高的組分進行超濾。超濾管規格為3 kDa、15 mL，每次超濾10 000 r/min離心15 min。取第1次濾下的組分收集，作為樣品中分子質量＜3 kDa的組分，未濾下的組分加入超純水補至原體積，再次進行超濾并重復2 次，收集未濾下的部分，補超純水至原體積并收集，作為樣品中分子質量＞3 kDa的組分。分別測定2 個組分的總抗氧化活性。

1.3.8 液相色譜-串聯質譜分析

使用液相色譜-串聯質譜進行分析[26]，色譜分離時間90 min，流動相A為2%乙腈（加入0.1% TFA），流動相B為80%乙腈（加入0.1% TFA），流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表 1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

質譜掃描范圍（m/z）為350～1 300，采集模式為數據依賴采集（data-dependent acquisition，DDA）模式；選擇母離子中信號最強的20 個進行二級碎裂；一級質譜分辨率為70 000，碎裂方式為高能誘導裂解（higherenergy collisional dissociation，HCD）；二級分辨率為17 500，動態排除時間為18 s。對于質譜得到的數據使用軟件PEAKS Studio 8.5進行查庫，查庫時將raw文件提交至PEAKS Studio 8.5服務器，選擇已經建立好的數據庫，進行數據庫搜索。

1.3.9 抗氧化活性肽的預測與驗證

通過生物活性肽數據庫BIOPEP檢索抗氧化肽的數據，使用基本局部相似性比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST），與液相色譜-串聯質譜分析得到的動物雙歧桿菌乳亞種B013培養物上清液中的肽序列進行序列比對，篩選可能的抗氧化肽。對于篩選出的肽，使用在線折疊軟件PEP-FOLD 3.5[27]和BIOVIA Discovery Studio 2.5軟件進行分子動力學模擬，得到肽分子的計算機模擬構象。按照肽序列人工合成實驗推測的抗氧化肽，驗證其抗氧化活性。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016、R3.5.2、IBM SPSS Statistics 21、Origin 9.0、Design-Expert 8軟件進行數據處理與繪圖。

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性測定標準曲線

通過抗氧化劑檢測試劑盒測得的Trolox濃度與A405nm的線性回歸方程為y=-2.667 9x+1.581 3（R2=0.994 9）。

2.2 抗氧化活性培養物上清液培養體系的選擇

圖 1 不同培養體系得到的培養物上清液的總抗氧化活性Fig. 1 Total antioxidant activity of culture supernatants obtained from different culture systems

由圖1可知，培養體系為生理鹽水+葡萄糖時，培養物上清液的總抗氧化活性顯著高于其他培養體系，因此在后續的實驗中對此體系進行優化，進一步提高培養物上清液的抗氧化活性。

2.3 抗氧化活性培養物上清液培養體系響應面優化

由表2～3可知：響應面模型的F值為18.801 3，P值為0.000 4，表明模型顯著，只有0.04%的可能性是由于噪聲造成了模型F值增大；A、A2、B2、C2是模型的顯著項，失擬項F值為3.628 9，P值為0.122 6，大于0.10，表明失擬項不顯著，模型選取恰當。

通過模型預測，菌量（OD600nm）為0.66、培養時間為17.84 h、葡萄糖添加量為3.04%時，培養物上清液的總抗氧化活性最強，達到0.342 mmol Trolox/L。對模型預測的培養體系（菌量（OD600nm）0.66、培養時間17.84 h、葡萄糖添加量3.04%）進行驗證，培養物上清液的總抗氧化活性為（0.339±0.004） mmol Trolox/L，與模型預測值接近。表明模型建立較好，能夠比較準確地預測培養體系與培養物上清液抗氧化活性之間的關系。由圖2～4可知：菌量對培養物上清液抗氧化活性的影響不顯著，曲面延A軸方向較平緩；培養時間與葡萄糖添加量對培養物上清液抗氧化活性的影響較顯著，曲面延B軸和C軸方向較陡峭。

表 2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表 3 二次模型響應面方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of response surface quadratic polynomial model

圖 2 菌量（OD600 nm）與培養時間交互作用的等高線圖與響應面圖Fig. 2 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of inoculum size (OD600 nm) and culture time on antioxidant activity of culture supernatant

圖 3 菌量（OD600 nm）與葡萄糖添加量交互作用的等高線圖與響應面圖Fig. 3 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of einoculum size (OD600 nm) and glucose concentration on antioxidant activity of culture supernatant

圖 4 培養時間與葡萄糖添加量交互作用的等高線圖與響應面圖Fig. 4 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of culture time and glucose concentration on antioxidant activity of the culture supernatant

2.4 培養物上清液的抗氧化活性成分分析

圖 5 不同處理后培養物上清液的總抗氧化活性Fig. 5 Total antioxidant activity of culture supernatant after different treatments

由圖5可知：100 ℃加熱后樣品的總抗氧化活性無顯著變化，表明活性物質不是蛋白質（蛋白質加熱后會變性，喪失活性）；蛋白酶K處理后樣品的總抗氧化活性顯著降低，表明活性物質可能是蛋白質或生物活性肽（蛋白質或生物活性肽含有肽鍵，會被蛋白酶K降解，因而活性發生改變）；β-葡萄糖苷酶和纖維素酶處理后樣品的總抗氧化活性沒有顯著變化，表明活性成分不是多糖（多糖會被β-葡萄糖苷酶和纖維素酶降解）。綜合以上分析，能夠確定樣品中的抗氧化活性物質是生物活性肽。

2.5 固相萃取結果分析

圖 6 不同體積分數乙腈洗脫產物的總抗氧化活性Fig. 6 Total antioxidant activity of eluates with different concentrations of acetonitrile

由圖6可知，乙腈體積分數為80%時，洗脫產物的總抗氧化活性顯著較高，表明抗氧化肽的非極性較強，主要溶解在乙腈體積分數為80%時的洗脫產物組分中。

2.6 超濾結果分析

由圖7可知，分子質量＜3 kDa的超濾組分抗氧化活性顯著高于分子質量＞3 kDa的超濾組分，表明活性肽分子質量較小，無需酶切，可以直接進行液相色譜-串聯質譜分析。

圖 7 不同超濾組分的總抗氧化活性Fig. 7 Total antioxidant activity of different ultra fi ltration fractions

2.7 液相色譜-串聯質譜分析結果

通過液相色譜-串聯質譜分析，檢測到樣品中共有8 種肽，序列如表4所示。

表 4 液相色譜-串聯質譜分析檢測結果Table 4 Information about eight peptides identified by LC-MS-MS

2.8 抗氧化活性肽的預測與驗證結果

通過BLAST比對，發現樣品中有1 個肽的序列與數據庫中的肽具有較高的相似度：七肽QYPLGPK和數據庫中的七肽HGPLGPL（ID 7889，來源于皮氏叫姑魚（Johnius belangerii）皮膚[28]）序列較為相似。

通過分子模擬，得到肽QYPLGPK的構象如圖8所示，含有暴露在外的酪氨酸殘基（第2位）和賴氨酸殘基（第7位）。在肽中酪氨酸殘基的酚羥基可以作為氨基酸供體，賴氨酸殘基的氨基可以絡合金屬離子，有利于發揮抗氧化能力[29]。經過驗證，質量濃度10 mg/mL肽QYPLGPK的總抗氧化活性為（0.249±0.011） mmol Trolox/L。

圖 8 通過分子模擬得到的肽QYPLGPK構象圖Fig. 8 Conformation diagram of peptide QYPLGPK by molecular simulation

3 結 論

通過響應面法優化動物雙歧桿菌乳亞種B013培養上清液的抗氧化活性，得到最優的培養體系為菌量（OD600nm）0.66、培養時間17.84 h、葡萄糖添加量3.04%。通過不同的酶和溫度處理，確認培養物上清液的抗氧化活性來源于其中的生物活性肽。通過固相萃取和超濾對培養物上清液中的生物活性肽進行分離純化，產物經過液相色譜-串聯質譜分析，確定出其中含有8 種肽。通過生物信息學和計算機模擬，篩選出其中有1 種肽（QYPLGPK）可能具有抗氧化活性。經過驗證，質量濃度10 mg/mL的肽QYPLGPK的總抗氧化活性為（0.249±0.011） mmol Trolox/L。對于該抗氧化肽的作用機理有待進一步研究。

在生產實際應用中，一方面可以直接將動物雙歧桿菌乳亞種B013開發為益生菌制劑，另一方面可以使用動物雙歧桿菌乳亞種B013開發乳品發酵劑，或將來源于動物雙歧桿菌乳亞種B013的抗氧化肽作為食品添加劑，開發出具有抗氧化作用的功能食品。