水稻新型胞質不育系L-orfH79與其同核異質YTA的比較

李佳洋 田澤 李威濤 劉學群 王春臺 譚艷平

摘要[目的]驗證新型細胞質不育系L-orfH79與其同核異質的近等基因系HL-CMS YTA的區別。[方法]用orfH79和orf290這2種分子標記對L-orfH79和YTA進行分子鑒定，并比較其花粉染色特性、花粉育性、結實率及orfH79表達量。[結果]分子標記鑒定結果顯示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290，YTA同時含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉積比YTA更少，L-orfH79花粉大小均勻，而YTA的花粉形態不一。L-orfH79花粉育性、套袋結實率及自然結實率（都低于10%）略高于YTA（都低于5%）。當L-orfH79中引入恢復基因Rf5或者Rf6后花粉形態和顏色都恢復正常。抽穗期L-orfH79劍葉中的 orfH79表達量低于YTA，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后會減少orfH79的表達量。[結論]L-orfH79是不同于YTA的新型細胞質雄性不育系，L-Rf5、L-Rf6可作為其恢復系。

關鍵詞 水稻;細胞質雄性不育系;L-orfH79;育性

中圖分類號 S511文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0097-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.027

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Abstract[Objective]In order to verify the difference between the new cytoplasmic male sterile line LorfH79 and its isonuclear alloplasmic sterile lines HLCMS YTA.[Method]LorfH79 and YTA were identified by molecular markers orfH79 and orf290， of which pollen dyeing characteristics， pollen fertility， seed setting rate and expression level of orfH79 were compared.[Result]It showed that both orfH79 and orf290 in YTA， while LorfH79 only contained orfH79 but not orf290 by molecular marker identification. The starch deposition of LorfH79 pollen was less than that of YTA. The size of LorfH79 pollen was uniform， but the morphology of YTA pollen was different. The pollen fertility， bagging seed setting rate and natural seed setting rate of LorfH79（all below 10%） were slightly higher than YTA （all below 5%）. Pollen morphology and color returned to normal when the restorer gene Rf5 or Rf6 was introduced into LorfH79. The expression of orfH79 in flag leaves of LorfH79 was lower than that of YTA. The expression of orfH79 reduced in sterile line LorfH79 after introducing Rf5 or Rf6.[Conclusion]LorfH79 is a new cytoplasmic male sterile line that different from YTA. LRf5 and LRf6 can be used as restorer lines.

Key words Rice;Cytoplasmic male sterility;LorfH79;Fertility

基金項目 湖北省技術創新專項重點項目（2018BFC360）;湖北省自然科學基金項目（2018CFB481）;中央高校基本科研業務費專項（CZY18029，CZP17017）。

作者簡介 李佳洋（1992—），男，湖北來鳳人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事分子遺傳學研究。

收稿日期 2019-03-16

水稻細胞質雄性不育是在發育過程中雌蕊正常而花粉敗育的現象，屬于母性遺傳，而特定的基因可以使其育性得到恢復。根據雜種F1代所產生的攜帶S（rf）基因型的雄配子的育性表型，可將CMS細胞質劃分為孢子體細胞質雄性不育（sporophytic type）和配子體細胞質雄性不育（gametophytic type）2種類型[1-2]。孢子體細胞質雄性不育其雄配子（花粉）的育性受孢子體（植侏）的基因型控制，而與雄配子本身所攜帶的核基因無關。配子體細胞質雄性不育其雄配子的育性直接由雄配子（花粉）本身的基因型所決定，與孢子體（植株）基因型無關[3]。水稻花粉敗育分典敗、圓敗和染敗，用I2-KI染色后分別呈現出皺縮不著色，圓形不著色，圓形著色淺且大小不一。1972年，朱英國院士利用紅芒野生稻作母本、蓮塘早栽培稻作父本雜交，后代得到雄性不育株連續回交多代得到穩定的紅蓮型細胞質雄性不育系HL-CMS YTA，屬配子體不育，YTB是YTA的同核異質保持系[4]。orfH79是YTA中atp6下游200 bp處的可編碼79個氨基酸的嵌合片段，ORFH79通過與紅蓮雄性不育水稻細胞質電子傳遞鏈復合體Ⅲ亞基相互作用而損害線粒體功能最終導致不育[5]。orfH79與BT-CMS中的不育基因orf79有96%的同源性[6-7]。HL-sp1是從YTA克隆的與orfH79沒有序列同源性的HL-CMS不育相關的候選基因片段[8]，通過Tail-PCR 將該片段擴大至6.7 kb[9]，在HL-sp1中預測到一個新的不育候選基因orf290，因此YTA中包含至少2種不育基因orfH79和orf290[10]。利用orfH79和orf290這2個分子標記，從102份AA基因型野生稻中篩選得到了6個只含有orfH79而不含有orf290的品種，經與YTB反復回交并結合分子標記篩選，獲得了與紅蓮水稻不育系YTA同核異質的近等基因不育系，命名為L-orfH79[11]。前期實驗室還以YTA作母本構建了YTA的同質異核近等基因恢復系L-Rf5和L-Rf6[12]，它們可以穩定地恢復L-orfH79的育性。該研究擬通過DNA水平、RNA表達水平及花粉形態及育性幾個方面比較具有相同的核背景但是細胞質不一樣的L-orfH79和YTA的區別與聯系，為該不育系的科研價值和應用推廣提供參考依據。

2 結果與分析

2.1 新型胞質不育系L-orfH79不育基因的分子標記檢測

用orfH79和orf290 2個分子標記在L-orfH79材料和YTA、YTB中擴增，結果表明YTA和L-orfH79材料都含有orfH79，同時YTA還含有orf290，但L-orfH79材料不含orf290（圖1）。

2.2 新型胞質不育系L-orfH79花粉形態特征

對新型胞質不育系L-orfH79花粉用1% I2-KI染色，相同觀測條件下L-orfH79的淀粉沉積比YTA更少（圖2）。統計結果顯示L-orfH79花粉幾乎全為不育，85%屬于圓敗，8%屬于典敗，L-orfH79花粉大小十分均勻。而YTA的花粉84%屬于圓敗，13%屬于典敗，形態不一。當L-orfH79中引入恢復基因Rf5或者Rf6后花粉形態和顏色都恢復正常。

2.3 新型胞質不育系L-orfH79育性特征

分別統計8株

L-orfH79與YTA的育性，結果如表2。就花粉育性而言，L-orfH79為8.0%，略高于YTA的3.5%;L-orfH79的套袋結實率為6.9%，比YTA的3.1%略高;自然結實率L-orfH79為85%，略高于YTA的4.7%。綜上所述，從花粉育性、套袋結實率、自然結實率3個方面都說明L-orfH79不同于YTA，YTA的育性更低且更穩定，但是 L-orfH79的育性也十分接近一個成熟不育系的育性。

2.4 不育基因orfH79相對表達量的比較分析

為了分析YTA和L-orfH79在不育基因orfH79表達量上的區別以及恢復基因Rf5、Rf6對orfH79表達量的影響，提取YTA、L-orfH79、L-orfH79/L-Rf5、L-orfH79/L-Rf6抽穗期劍葉中RNA，反轉成cDNA后用內參基因cob檢測其質量，檢測結果顯示質量很好（圖3），可以進行后續表達量分析。不同材料中orfH79的表達量測定結果表明L-orfH79抽穗期劍葉中orfH79的表達量低于YTA中，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后會減少orfH79的表達量（圖4）。

3 討論

通過與YTB反復回交多代，并用分子標記orfH79和orf290篩選得到只含有orfH79的不育系 L-orfH79和同時含有 orfH79和orf290的不育系YTA。有研究表明這種構建不育系的方式可以得到核背景一樣但細胞質不同的不育系[13-14]。該研究從DNA水平、RNA水平和花粉鏡檢以及結實率統計等方面對L-orfH79和YTA進行了比較，發現它們有本質的區別，L-orfH79比YTA少了不育基因orf290，且YTA中的orf290在不同部位都有一定的表達量[15]。L-orfH79中orfH79的相對表達量低于YTA，但是卻有著和YTA相近的不育特征，這都說明了L-orfH79是一種不同于YTA的不育系，且育性可以被恢復基因Rf5或Rf6通過下調orfH79的表達量而恢復。這為紅蓮型水稻胞質雄性不育的核質互作機理研究提供了種質資源。豐富了三系雜交水稻的多樣性，將為不育基因后期理論研究和應用研究提供基礎。但是L-orfH79和YTA主要不育機理的區別還需要進一步研究。

參考文獻

[1]LAUGHNAN J R，GABAYLAUGHNAN S.Cytoplasmic male sterility in maize[J].Ann Rev Genet，1983，17：27-48.

[2]SCHNABLE P S，WISE R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J].Trends Plant Sci，1998，3（5）：175-180.

[3]朱英國.水稻雄性不育生物學[M].武漢：武漢大學出版社，2000：111-112，115

[4]武漢大學遺傳研究室.紅芒野稻—蓮塘早不育系花粉敗育過程的細胞形態學觀察[J].武漢力學學報（自然科學版），1977（1）：5-12.

[5]WANG K，GAO F，JI Y X，et al.ORFH79 impairs mitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice[J].New phytologist，2013，198（2）：408-118.

[6]龍偉雄，廖佛才，鄭卓，等.水稻配子體細胞質雄性不育基因orf79/orfH79的變異多態性研究[J].井岡山大學學報（自然科學版），2014，35（5）：101-106.

[7]易平，汪莉，孫清萍，等.紅蓮型細胞質雄性不育線粒體相關嵌合基因的發現[J].科學通報，2002，47（2）：130-133.

[8]劉學群.水稻紅蓮型細胞質雄性不育候選基因的篩選與恢復基因的精細定位[D].武漢：武漢大學，2004.

[9]李丕順，劉學群，王春臺，等.TAIL-PCR對紅蓮型水稻不育系特異片段HL-sp1側翼序列的分析[J].湖北農業科學，2008，47（2）：123-126.

[10]楊夢醒，姜慧，田澤，等.水稻線粒體基因orf290功能的初步研究[J].華中農業大學學報，2018，37（6）：1-6.

[11]劉京.水稻兩種新型胞質不育系及其恢復系的篩選[D].武漢：中南民族大學，2015.

[12]華宇峰.紅蓮型CMS近等基因恢復系及同核異質不育系的構建[D].武漢：中南民族大學，2014.

[13]李陽生，李紹清，朱仁山，等.生物技術在水稻超高產育種中的應用[J].沈陽農業大學學報，2007，38（5）：701-706.

[14]劉京，劉杰，喻博倫，等.新型不育胞質在栽培稻中的分布與鑒定[J].中國農學通報，2015，31（23）：43-46.

[15]陳為，周杰，譚艷平，等.水稻HL-CMS中2個雄性不育候選基因表達模式的初步研究[J].華中農業大學學報，2009，28（4）：394-397.