小鼠白假絲酵母菌陰道炎模型中微環(huán)境的變化研究

拜紅霞 陸顯義 施啟豐 房靈 顧敏紅 陸勝 王昊玨△

(無錫市錫山人民醫(yī)院/東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院無錫分院，(1.檢驗(yàn)科；(2.婦產(chǎn)科；(3.病理科；(4.皮膚科，江蘇 無錫 214015)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是育齡婦女常見的條件真菌感染，絕大部分感染由白假絲酵母菌引起，約占85%～90%[1-2]。相關(guān)研究常用小鼠陰道炎模型進(jìn)行，在構(gòu)建白假絲酵母菌陰道炎模型中雌激素化發(fā)揮著重要作用[3-4]。以往雌激素化的方法為肌注苯甲酸雌二醇，但隨著藥品市場(chǎng)的更新?lián)Q代，苯甲酸雌二醇難尋蹤影。本研究擬通過喂食戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂)片劑達(dá)到雌激素化的目的來建立陰道炎小鼠模型，并了解其微環(huán)境變化情況，以期為白假絲酵母菌陰道炎相關(guān)研究提供合適替代的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1儀器 型號(hào)BSC-1004IIA生物安全柜(蘇凈安泰AIRTECH公司)；MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下)；MODELCX23LEDRFS1C型生物顯微鏡(日本奧林巴斯)；型號(hào)YXQ-LS-50壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)； Multiskam Ascent型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭雷勒公司)。

1.2試藥 戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂，DELPHARM Lille S.A.S.公司，批號(hào)：198A3);瓊脂粉(批號(hào)：20170406)、蛋白胨(批號(hào)：20170518)、葡萄糖(批號(hào)：20170214)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)雌性ICR小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007。 在江蘇省血吸蟲病防治研究所動(dòng)物房[許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0050]分籠飼養(yǎng)，控制環(huán)境溫度(20±2) ℃，濕度55%～65%，光照12 h，嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.4菌株 白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(編號(hào)：AF206001，批號(hào)：20170721)。

1.5菌懸液的制備 將菌株接種在含1%蛋白胨和4%葡萄糖液培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，16～18 h后取出，于無菌操作臺(tái)中混勻后，取1 mL菌液測(cè)其在560 nm處的吸光度(A)值，根據(jù)測(cè)得的菌液A值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上相比較得到菌液濃度。用生理鹽水將菌液稀釋為5×108cfu·mL-1，取1 只小鼠腹腔注射1 mL菌液，待小鼠死亡后，對(duì)其腹部進(jìn)行酒精消毒后剖開腹腔，用無菌棉簽取樣，接種于培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16～18h。用生理鹽水再將菌液稀釋為5×108cfu·mL-1，另取1只小鼠重復(fù)接種、取樣，菌液經(jīng)過打入小鼠腹腔轉(zhuǎn)種2次增強(qiáng)毒力后再在1%蛋白胨和4%葡萄糖液培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16～18 h，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)調(diào)整菌懸液濃度[5]，使菌懸液濃度為5×108cfu·mL-1。

1.6動(dòng)物分組及模型建立 將160只小鼠隨機(jī)分成四組：戊酸雌二醇低劑量組(A，0.005 mg/10 g)、戊酸雌二醇中劑量組(B，0.05 mg/10 g)，戊酸雌二醇高劑量組(C，0.5 mg/10 g)，正常對(duì)照組(D)，每組40只。A、B、C組小鼠在接種白假絲酵母菌前給予戊酸雌二醇混懸液灌胃，D組小鼠給予同體積(0.10 mL/10 g)生理鹽水，連續(xù)灌胃21 d。灌胃第8天為造模日，于小鼠陰道內(nèi)灌入20 μL菌懸液(含菌量1×107cfu)。每天觀察小鼠精神狀態(tài)、外陰及分泌物情況。

1.7指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1pH 值檢測(cè) 分別于造模后第2 、4、7、14天隨機(jī)取小鼠5只，用自制小棉簽無菌生理鹽水濕潤(rùn)后，用無菌脫脂棉吸除多余水分，插入小鼠陰道，旋轉(zhuǎn)2周沾取分泌物，滴在精密pH 試紙上，迅速與比色卡比色，并記錄結(jié)果[6]。

1.7.2血清雌激素水平測(cè)定 灌洗日小鼠取尾血后處死。血液置于無菌離心管中，放于低溫高速離心機(jī)中15 000 rpm，離心15 min[7]，用微量加樣器取血清液，置于無菌離心管中，存放于-80 ℃冰箱中保存。標(biāo)本收集完整后，按試劑盒的說明書檢測(cè)小鼠血中雌激素濃度。

1.7.3陰道灌洗液菌落計(jì)數(shù) 確定接種后的第2、4、7、14天為灌洗日，每個(gè)灌洗日各組隨機(jī)另選取5只小鼠，先用微量加樣器取100 μL 無菌 PBS 反復(fù)沖洗陰道 8～10 次，灌洗液置于潔凈無菌管中，取 10 μL 涂片鏡下觀察芽生孢子及菌絲生成情況，取10 μL接種于保羅瓊脂培養(yǎng)基上 35 ℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU計(jì)數(shù)即菌落形成單位，以個(gè)菌落/mL為單位計(jì)數(shù))[8]。另取 50 μL 灌洗液用 PBS 10 倍比稀釋到 10-6，每個(gè)稀釋度分別取 50 μL 涂于 Rogasa 培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度設(shè)兩個(gè)平行板，涂布棒涂布均勻。置燭缸中，37 ℃，48 h 培養(yǎng)后，選取 30 300 個(gè)菌落的平板乳桿菌鑒定及活菌計(jì)數(shù)(CFU/mL)[9]鑒定乳桿菌，凡符合下列條件者均可認(rèn)為是乳桿菌[10]： (1)革蘭氏染色陽(yáng)性，無芽孢，細(xì)長(zhǎng)有彎曲或呈球桿狀、桿狀，單個(gè)、成雙或鏈狀，無動(dòng)力; (2)微需氧或兼性厭氧，但在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)更好; (3)生長(zhǎng)最適溫度為 37 ℃，最適pH值5.6～6.2; (4)觸酶陰性，不產(chǎn)色素; (5)分解葡萄糖。

1.8陰道組織病理學(xué)檢查 灌洗日小鼠取尾血后處死。取陰道組織(1.5 cm×2.0 cm)立即置于4%多聚甲醛溶液中。將4%多聚甲醛溶液浸泡24 h后的小鼠陰道組織作石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色[11]。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察結(jié)果 正常對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中飲食正常，未見煩躁、 外陰紅腫、分泌物增加等現(xiàn)象出現(xiàn);其余各組在接種白假絲酵母菌后相繼出現(xiàn)煩躁、外陰紅腫、分泌物增加等現(xiàn)象。

2.2陰道灌洗液涂片鏡檢 A、B、C組小鼠自第2 天起灌洗液涂片可見芽生孢子和假菌絲，第4 、7 天的涂片中尤為密集，D組僅第2 天有少量芽生孢子及假菌絲，第4天未見真菌生長(zhǎng)。

2.3陰道 pH情況 接種后，各組小鼠陰道 pH 值均升高，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見表1。

表1 小鼠陰道 pH 值

注：與正常對(duì)照組相比，☆P<0.05。

2.4血中雌激素濃度 喂食不同劑量的戊酸雌二醇后，小鼠血中雌激素濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 小鼠血中雌激素濃度

2.5陰道乳桿菌計(jì)數(shù) A、B、C組小鼠陰道乳桿菌菌落數(shù)都明顯降低，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組小鼠陰道乳桿菌菌落數(shù)持續(xù)降低，在接種的第7天逐漸開始升高。見表3。

表3 小鼠陰道乳桿菌菌落數(shù)[活菌數(shù)

注：與正常對(duì)照組相比，☆P<0.05。

2.6小鼠陰道灌洗液白假絲酵母菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 各組小鼠在接種后各灌洗日取其陰道灌洗液進(jìn)行白假絲酵母菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表4。自第2天起，A、B、C三組小鼠陰道內(nèi)即有較高水平的cfu并持續(xù)至觀察期末，于第4天達(dá)峰值，后逐漸下降；第4、7天A、B、C組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。至第14天，A、B、C組兩兩相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 接種后不同時(shí)點(diǎn)三組小鼠陰道灌洗液真菌載量比較

注：A、B、C組兩兩比較，△P>0.05；☆P<0.01。

2.7HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組小鼠陰道組織未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，戊酸雌二醇低、高劑量組小鼠陰道組織黏膜內(nèi)、黏膜下可見以多形核粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，戊酸雌二醇高劑量組最為明顯。 見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果

3 討 論

白假絲酵母菌是女性生殖道最常見的條件致病菌，75%的女性一生中至少患過一次白假絲酵母菌性陰道炎。白假絲酵母菌屬條件致病菌，其致病性主要取決于病原體的數(shù)量、毒力、入侵途徑以及機(jī)體的抵抗力、適應(yīng)性等[12]，機(jī)體內(nèi)的這種平衡狀態(tài)一旦被某些因素破壞，白假絲酵母菌便出芽生成假菌絲，酵母相轉(zhuǎn)變成菌絲相，大量繁殖，導(dǎo)致皮膚、黏膜及全身性的真菌病[13]。

乳桿菌是陰道里的正常菌群，乳桿菌可以通過產(chǎn)生乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素而對(duì)假絲酵母菌有拮抗作用。大量乳酸的產(chǎn)生可以降低陰道pH值，低pH值可以抑制假絲酵母菌的生長(zhǎng)，乳桿菌在體外可以干擾白假絲酵母菌對(duì)陰道上皮的粘附。正常情況下，雌激素可以影響乳桿菌的數(shù)量，當(dāng)雌激素水平升高時(shí)乳桿菌數(shù)亦升高。而假絲酵母菌是陰道中的條件致病菌，雌激素水平的升高可以使陰道上皮COX-2表達(dá)上調(diào)[14]，從而降低陰道局部免疫力，有利于假絲酵母菌的繁殖；且雌激素水平的升高也可以使糖原表達(dá)上調(diào)，糖原為假絲酵母菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，也利于假絲酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖。在假絲酵母菌性陰道炎中，白假絲酵母菌的大量繁殖可以升高陰道pH值，從而抑制乳桿菌的生長(zhǎng)，乳桿菌的減少導(dǎo)致陰道局部的抵抗力下降，從而加重了假絲酵母菌的感染。

高雌激素水平可增強(qiáng)白假絲酵母菌的毒力，使個(gè)體對(duì)白假絲酵母菌的易感性增加。以往研究多以尾靜脈注射苯甲酸雌二醇達(dá)到雌激素化后接種白假絲酵母菌建立白假絲酵母菌性陰道炎模型[15]。但苯甲酸雌二醇為油劑，且需尾靜脈注射，存在藥物難購(gòu)買、操作難度高等缺陷。故本實(shí)驗(yàn)采用戊酸雌二醇灌胃達(dá)到雌激素化。

本研究結(jié)果表明，小鼠陰道感染白假絲酵母菌后，高雌激素狀態(tài)更利于白假絲酵母菌的繁殖，乳桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，小鼠陰道pH值升高，更不利于乳桿菌的生長(zhǎng)，乳桿菌的絕對(duì)數(shù)量也是降低的。

本研究發(fā)現(xiàn)，戊酸雌二醇高劑量組菌落計(jì)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均高于其它組，并于第4天達(dá)到高峰(6.825±1.247)，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，該組在HE染色下可見有PMNs浸潤(rùn)。此外，A、B、C各組菌落計(jì)數(shù)均呈現(xiàn)出先升高后下降的態(tài)勢(shì)，這可能與白假絲酵母菌毒力減弱、小鼠陰道的自凈作用有關(guān)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，戊酸雌二醇灌胃可達(dá)到雌激素化的目的，雌激素濃度高低對(duì)小鼠陰道菌落形成有顯著影響，并能改變小鼠的陰道微環(huán)境。高濃度雌激素更易獲得小鼠陰道炎模型。