光譜法研究銅離子熒光探針與人血清白蛋白的相互作用

朱琳，馬明碩，柳彩云

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學院 分析測試中心，吉林 吉林 132022；3.濟南大學 資源與環境學院，山東 濟南 250022)

人血清白蛋白(HSA)主要特點是能與許多內源性和外源性化合物相互結合，在人體內主要承擔載體的任務[1-3]。通過相互作用的研究，可以為物質代謝、蛋白質的構象研究以及物質與白蛋白結合的本質研究提供重要的數據以及理論指導。本實驗設計識別碼為Cu2+的羅丹明類化合物探針(DQX-1，圖1)，通過對探針與人血清白蛋白的相互作用的研究，得到了結合常數、結合位點數、結合距離，以及本探針對人血清白蛋白構象的影響，并從分子水平上解釋了兩者之間的相互作用。這些內容是研究臨床動力學以及臨床藥理所重點關注的內容，不僅為進一步探討探針的識別原理提供了科學依據，同時對于新型探針的設計以及應用也有特別的價值。

圖1 DQX-1結構式Fig.1 The structure of DQX-1

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

HSA(Sigma)，濃度為10-5mol/L的備用液是用二次蒸餾水配制成；濃度為10-3mol/L的探針DQX-1備用液是用三氯甲烷配成的；Tris(用蒸餾水和三羥甲基氨基甲烷配制成10-2mol/L 500 mL溶液，pH=7.4)緩沖液；三氯甲烷、三羥甲基氨基甲烷均為分析純；水為二次蒸餾水。

Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計；UV2550型紫外可見分光光度計；Jasco-810圓二色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定探針與HAS之間相互作用 用刻度移液管分別移取準確量的HSA溶液和探針溶液到5.0 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，使HSA與DQX-1的濃度比為0～10。測試條件：280 nm的激發波長，5 nm的狹縫，在300～450 nm 范圍內測定HSA的熒光光譜。

1.2.2 紫外吸收光譜測定探針與HSA相互作用 用刻度移液管分別移取準確量的HSA溶液和探針溶液到5.0 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，使HSA與DQX-1的濃度比為0～10。并且以二次蒸餾水作為空白能比，測定體系在200～450 nm范圍內的紫外吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 紫外吸收光譜

圖2是HSA在不同濃度DXQ-1存在下的紫外-可見吸收光譜圖。

圖2 不同探針DQX-1濃度條件下的HSA紫外-可見吸收光譜Fig.2 The absorbance spectra of HSA with the different concentration of DQX-1

由圖2可知，HSA在大約280 nm處有吸收峰。在280 nm處的吸收峰是由HSA中芳香族氨基酸產生的，隨著加入HSA溶液中的探針DQX-1濃度的增加，HSA在280 nm處的特征吸收強度逐漸增大，特征吸收光譜發生藍移。結果表明，HSA與探針DQX-1結合后，改變了HSA的芳香族氨基酸殘基的微環境極性[4]。

2.2 熒光光譜

不同探針濃度條件下HSA的熒光光譜見圖3。

圖3 不同探針DQX-1濃度條件下HSA的熒光光譜Fig.3 The fluorescence spectra of HSA with the different concentration of DQX-1

由圖3可知，隨加入探針DQX-1濃度的逐漸增加，HSA的熒光強度會逐步的降低，并且最大發射波長從334 nm藍移到330 nm，表明DQX-1的加入不僅使HSA的熒光猝滅，同時也導致熒光生色團色氨酸以及酪氨酸所處的環境疏水性增加[5]。從計算得到的DQX-1與HAS之間的猝滅常數(Kq)均為1012數量級左右，遠大于2×1010L/(mol·s)的最大動態熒光猝滅常數，同時結合二者之間的紫外吸收光譜圖(圖2)，進一步表明二者之間的熒光猝滅作用為靜態猝滅[6]。

2.3 探針與HSA的結合常數與結合位點數

對于靜態猝滅，如果生物分子中有相似且獨立的結合位點，則可應用式(1)獲得結合常數以及結合位點數[7]。

(1)

其中，n為結合位點數，可由熒光數據根據式(1)作圖得到。計算得到的K和n的值見表1。

表1 不同溫度下DQX-1與HSA的相互作用參數Table 1 The interaction parameters of DQX-1 with HSA at different temperatures

由表1可知，結合位點數n大約為1，表明每個HSA分子能夠結合一個探針DQX-1分子。隨著溫度的增加，K和n值逐漸下降。

2.4 熱力學分析和結合力類型的確定

生物大分子與有機物小分子之間的作用類型可歸納為四種類型，氫鍵、范德華力、靜電引力及疏水作用力。根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS結果，就可得到有機物小分子與蛋白質之間的主要作用力類型。判斷根據為：①若ΔS<0、H<0是氫鍵和范德華力；②若ΔS>0、H>0是疏水作用力； ③若ΔS>0、H<0是靜電引力。如果焓變(ΔH)在所研究溫度范圍內變化很小，該反應的焓變是一個常數。熵變值(ΔS)和焓變值(ΔH)可以通過Van’tHoff等式進行計算：

(2)

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

由表1可知，ΔH<0，ΔS<0，所以主要是氫鍵和范德華力占主導作用[8]，由表中的數據可得ΔG<0，說明結合反應可自發進行。

2.5 探針DQX-1與HSA之間的結合距離

探針DQX-1在蛋白質上的結合距離可以根據F?rster的非輻射共振能量轉移理論計算出，并且也能計算出能量轉移效率E，結合距離不僅僅與藥物受體和蛋白質供體的距離有關，還與能量轉移的臨界距離(R0)有關。能量轉移效率(E)計算公式如下：

(4)

其中，R0為50%轉移效率的臨界距離，r為蛋白質和有機小分子間的距離。R0可通過以下關系式計算得：

(5)

其中，K2為偶極子空間定位因子，取值為2/3；n為介質的折射指數，取1.36；ΦD為供體的熒光量子產量，取值為0.15；J為蛋白質發射光譜和有機小分子吸收光譜之間的光譜重疊部分的積分值。如圖6所示，可通過下式積分得到：

(6)

其中，F(λ)為在波長λ處蛋白質分子的熒光強度；ε(λ)為波長為λ時有機小分子的摩爾吸收系數。

根據圖4，由計算求得如下參數：J=6.267 5×10-14cm3·L/mol，R0=3.42 nm和r=5.42 nm。很明顯HSA與探針DQX-1-1的距離(r)遠<8 nm，并且符合0.5R0

圖4 HSA的熒光發射光譜與探針DQX-1的吸收光譜Fig.4 The fluorescence spectra of HSA and absorption spectra of DQX-1

2.6 探針對HSA構象的影響

2.6.1 同步熒光光譜研究 圖5分別為測得的HSA中酪氨酸基團、色氨酸基團的同步熒光光譜。

圖5 不同DQX-1濃度條件下 HSA的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectrum of HSA with different concentration of DQX-1

由圖5可知，加入DQX-1后，二者的熒光均下降，但是色氨酸基團的熒光強度下降得比較明顯并且發生了輕微的藍移。實驗證明，DQX-1與HSA 作用后，降低了HSA的疏水性、增加了HAS的極性，改變了二級結構[9]。

2.6.2 三維熒光光譜 三維熒光光譜技術近年來已經成為一種常用的熒光分析技術，可以為研究HSA的構象變化提供詳細的信息[10]。圖6為HSA加入DQX-1前后的三維熒光光譜。

由圖6可知，HSA的熒光強度下降，最大發射波長發生藍移。因此可得，DXQ-1的加入會引起HSA結構的輕微構象變化。

圖6 探針DQX-1對HSA三維熒光光譜的影響Fig.6 The effect of DQX-1 on the three-dimensional fluorescence spectrum of HSA

3 結論

本文研究了銅離子探針DQX-1與HSA之間相互作用的熒光光譜、紫外吸收光譜。并且DQX-1對HSA產生了明顯的熒光猝滅效應，由猝滅機理推斷為靜態猝滅。通過熒光光譜，可以計算得到不同溫度下二者的結合常數、熱力學常數、作用力類型。由三維熒光光譜以及紫外吸收光譜可以看出，DQX-1的加入可以使HSA的二級結構發生改變。