益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究

羅倫才 羅丹 童妍

615000涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院1，四川 西昌

610031西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2，四川 成都

益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶屬新型中藥復(fù)方制劑，具有安養(yǎng)五臟、潤(rùn)燥通便、降脂通脈功能。研究證實(shí)[1-3]，益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶中黃精多糖、黃芪總黃酮能有效逆轉(zhuǎn)或修復(fù)環(huán)磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠的免疫功能。天然中草藥具有一定的調(diào)節(jié)免疫功能，且毒副作用少。本文主要探討益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶對(duì)于免疫抑制小鼠是否有免疫調(diào)節(jié)作用。

資料與方法

試驗(yàn)藥物：益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶；CTX。

動(dòng)物：KM 小鼠，雌雄各半，60只，體重18～22 g，合格證號(hào)：SCXK(川)2013-24。

試劑：考馬斯亮蘭(A045-2)、酸性磷酸酶(ACP)測(cè)試盒(A060-1)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(A020-1)；1640 培養(yǎng)基(SH30809.01)、胰酶(J150031)；二甲基亞砜(D-5879)、 LPS(L2880)、 刀 豆 蛋 白A(ConA)(C2272)、中性紅溶液(N6264)。

儀器：722可見分光光度計(jì)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器。

方法：小鼠隨機(jī)分為6 組，空白組、模型組、陽性組及益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶高、中、低劑量組，每組10 只。除空白組外，其余組給藥隔天進(jìn)行皮下注射CTX 30 mg/kg 建立免疫功能低下小鼠模型；陽性組左旋咪唑25 mg/kg，益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶高、中、低劑量組(5.08 g/kg、2.54 g/kg、1.27 g/kg)，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃10 d。

觀察指標(biāo)：①胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定，分別取胸腺、脾臟稱量濕重。②LDH 和ACP 活性測(cè)定，按試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。③按常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液，然后使用四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[4]。使用MTT法對(duì)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK 細(xì)胞)活性進(jìn)行測(cè)定。④按常規(guī)方法制備腹腔巨噬細(xì)胞，檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 16.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官、ACP 和LDH 活性的影響：胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定顯示，各組胸腺、脾臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1和表2。

ACP 活性測(cè)定：與空白組比較，模型組小鼠脾臟樣本中ACP 活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，陽性藥組、中劑量組ACP 活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

LDH統(tǒng)計(jì)結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠脾臟樣本中LDH活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，陽性藥組、中劑量組LDH 活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

對(duì)免疫抑制小鼠免疫細(xì)胞的影響：ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：與空白組比較，模型組的ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比，陽性組、高/中劑量組T淋巴細(xì)胞增殖數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表5。

表1 各試驗(yàn)組胸腺指數(shù)(±s)

表1 各試驗(yàn)組胸腺指數(shù)(±s)

組別 n 胸腺指數(shù)空白組 10 0.004 2±0.001 3模型組 10 0.002 5±0.000 4陽性藥組 10 0.002 3±0.000 5低劑量組 10 0.002 1±0.000 4中劑量組 10 0.001 8±0.000 6高劑量組 10 0.002 9±0.000 8

表2 各試驗(yàn)組脾臟指數(shù)(±s)

表2 各試驗(yàn)組脾臟指數(shù)(±s)

組別 送檢標(biāo)本(n) OD空白組 4 0.003 0±0.000 3模型組 4 0.003 0±0.000 6陽性組 5 0.002 7±0.000 6低劑量組 5 0.002 3±0.000 4中劑量組 3 0.002 0±0.000 3高劑量組 6 0.002 7±0.000 5

NK 細(xì)胞、LAK 細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果，見表6。

巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力：與空白組比較，模型組OD 值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，陽性組OD 值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，高、中劑量組OD 值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表7。

討 論

機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)時(shí)，機(jī)體的非特異性免疫功能下降，可表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞增殖和分化能力下降。淋巴細(xì)胞分為許多功能特異的群體，比如T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等，本次實(shí)驗(yàn)即對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。其中檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞的增殖能力可以在一定程度上反映細(xì)胞免疫功能。不同于T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，NK 細(xì)胞屬于直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的淋巴細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體的非特異性免疫功能下降時(shí)，也表現(xiàn)為NK 細(xì)胞活性降低。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)NK 細(xì)胞和LAK 細(xì)胞的殺傷活性，作為判斷機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的依據(jù)。在NK細(xì)胞活性測(cè)定中，與模型組相比，陽性組及益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶高、中、低劑量組的NK細(xì)胞活性有所升高。LAK細(xì)胞是體外誘導(dǎo)的非特異性殺傷細(xì)胞，許多研究表明，LAK 細(xì)胞的前體細(xì)胞就是NK 細(xì)胞。本研究中ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中，與模型組相比，陽性組及益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶高、中劑量組的脾臟細(xì)胞增多，結(jié)果顯示補(bǔ)腎養(yǎng)身茶可以促進(jìn)脾臟T 淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能。與模型組相比，陽性組益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶高、中、低劑量組的LAK 細(xì)胞數(shù)值均有所升高，表明益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶對(duì)免疫抑制小鼠有一定增強(qiáng)免疫功能的作用。

表3 ACP活性測(cè)定(±s)

表3 ACP活性測(cè)定(±s)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

組別 樣本數(shù)量(n) 活力(U/gprot)空白組 8 101 7.85±82.34模型組 11 898.66±94.51#陽性組 9 102 4.62±94.98?高劑量組 13 947.24±116.82中劑量組 6 104 4.03±163.25?低劑量組 9 894.39±144.49

表4 藥物對(duì)肝組織中LDH活力的影響(±s)

表4 藥物對(duì)肝組織中LDH活力的影響(±s)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

組別 樣本數(shù)量(n) 活力(U/g prot)空白組 8 457 99.12±793 1.06模型組 7 310 77.26±896 6.49#陽性組 6 413 04.32±774 4.87?高劑量組 7 377 30.21±925 5.49中劑量組 6 408 39.31±111 83.70?低劑量組 6 383 30.89±910 9.67

表5 ConA、LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響(±s)

表5 ConA、LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響(±s)

注：與空白組比較，△△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

?

表6 NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞活性(%)

表7 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s)

表7 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s)

組別 n OD空白組 6 0.79±0.01模型組 6 0.72±0.02△△陽性組 6 0.77±0.01??高劑量組 6 0.76±0.02?中劑量組 6 0.75±0.02?低劑量組 6 0.72±0.03

巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞免疫能力更強(qiáng)，而巨噬細(xì)胞活化的一個(gè)重要標(biāo)志是產(chǎn)生一氧化氮，實(shí)驗(yàn)分析了腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，在吞噬細(xì)胞吞噬能力測(cè)定中，與模型對(duì)照組相比，陽性組及高、中劑量組OD 值增加，間接說明了與模型組相比，這三個(gè)劑量組提高了免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。ACP 作為溶酶體酶，參與巨噬細(xì)胞吞噬外來病原體的過程，所以ACP 的活性高低在一定程度上反映了吞噬細(xì)胞的活化程度。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶中劑量組能提高免疫抑制小鼠的ACP 活力。LDH 是糖降解的必須酶，而吞噬細(xì)胞的吞噬過程則需要糖降解提供的能量，所以LDH 的活性與巨噬細(xì)胞激活的程度相關(guān)，是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志之一。在本次實(shí)驗(yàn)中，LDH 活性測(cè)定結(jié)果顯示，與模型組相比，陽性組、中劑量組LDH 活力升高。本研究證實(shí)，益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶各劑量組對(duì)免疫抑制大鼠表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)免疫能力的作用，這為益腎補(bǔ)氣強(qiáng)身茶的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)。