鹽酸克林霉素膠囊在中國健康受試者的藥動學及生物等效性研究

王晶晶， 郁繼誠， 武曉捷， 曹國英， 梁 虹， 金 逸， 何金杰， 張 菁， 施耀國，程潔如， 丁玲玲， 劉曉雪， 龔玉秀

克林霉素早在1966 年由Magerlein等以氯原子取代林可霉素分子中的第7位羥基首次合成而得，其作用于敏感菌核糖體的50S亞基，阻止肽鏈的延長，從而抑制細菌細胞的蛋白質合成[1]。克林霉素主要用于治療敏感革蘭陽性球菌和厭氧菌引起的感染，是治療金黃色葡萄球菌骨髓炎的首選藥物。其對需氧革蘭陽性球菌有較高抗菌活性，如葡萄球菌屬（包括耐青霉素及甲氧西林敏感株）、溶血鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌等；對厭氧菌亦有良好的抗菌作用，如桿菌屬、梭形桿菌屬、放線菌屬、消化球菌、消化鏈球菌等[2]?？诜}酸克林霉素胃腸道吸收迅速，達峰時間為0.75～2 h，蛋白結合率高達85%～94%，廣泛分布于除腦脊液外的體液和組織中，在骨組織、膽汁、尿液、胰液中可達高濃度[3-4]，也能透過胎盤，進入胎兒循環。該藥在肝臟代謝，部分代謝物具抗菌活性。約給藥量的10%以活性成分形式由尿排出，3.6%以活性成分形式由糞便排出。血漿消除半衰期（t1/2β）成人為2.4～3.0 h，兒童為2.5～3.4 h。腎衰竭及嚴重肝臟損害者t1/2β略有延長（3～5 h）。多次給藥未見藥物蓄積現象。血透及腹透不能清除克林霉素[5-6]。原研產品美國法瑪西亞普強公司（Pharmacia & Upjohn Co）生產的鹽酸克林霉素膠囊（CLEOCIN HCL）于1975年在美國上市。20 世紀80 年代中期克林霉素進入中國市場，已上市多年。國產鹽酸克林霉素由上海新亞藥業閔行有限公司研發。本研究通過比較中國健康受試者空腹和餐后口服國產鹽酸克林膠囊（受試制劑）與原研產品CLEOCIN HCL（參比制劑），評價受試制劑與參比制劑的生物等效性。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

受試制劑鹽酸克林霉素膠囊：規格300 mg，10粒/板，2板/盒，批號170901，含量101.8%，有效期2019年9月，上海新亞藥業閔行有限公司生產。參比制劑鹽酸克林霉素膠囊：規格300 mg，100粒/瓶，批號SGYP，含量101.2%，有效期2019年11月，Pharmacia&Upjohn Co.生產?？肆置顾貥藴势罚号?30422-201306，純度84.9%，中國食品藥品檢定研究院。內標克林霉素-d3鹽酸鹽（Clindamycin-d3 hydrochloride）：批號9-AKS-149-2，純度96%，失效期2020-01-25，Toronto Research Chemicals提供。

AB Sciex API 4000 QTRAP質譜儀為美國應用生物系統公司產品；UFLC 20-AD超快速液相系統為日本島津公司產品。

1.2 研究設計

本研究采用單中心、隨機、開放、單劑量、兩周期、兩交叉、空腹或餐后給藥試驗設計。由篩選期（-28～-1 d）及試驗期組成，其中試驗期分為第一周期（2 d）、清洗期（7 d）和第二周期（2 d）。篩選期選擇合格的健康成年受試者24名，每種性別不少于總人數的1/3，隨機分配至A（受試制劑/參比制劑）、B（參比制劑/受試制劑）兩個序列組中，按順序交叉給藥。本研究由復旦大學附屬華山醫院國家藥物臨床試驗機構承擔，研究方案經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會審批通過。

1.3 受試者

所有受試者均在簽署書面知情同意書后進入試驗。經詢問病史，無心、肝、腎、內分泌、消化道、免疫系統、呼吸系統、代謝異常、腫瘤和重癥肌無力等病史，無克林霉素或林可霉素、青霉素、阿司匹林藥物過敏史或過敏體質，無煙、酒嗜好，無藥物濫用史，3個月內無激素替代治療，28 d內無任何可能與克林霉素有相互作用藥物應用史，3個月內無＞400 mL出血或獻血史，非妊娠或哺乳期婦女，無48 h內服用影響肝臟代謝酶的食物或飲料者；經實驗室檢查包括血常規、尿常規、肝功能、腎功能、血脂、血液妊娠檢查，體格檢查，靜息狀態生命體征和12-導聯心電圖檢查均正?；驘o臨床意義異常，乙醇呼吸檢查和煙檢（尿可替寧檢測）陰性。試驗期間統一飲食，禁止吸煙、飲酒、攝入飲料，禁止劇烈運動。

1.4 給藥方法

受試者于每個周期給藥前1 d入住病房。服藥前禁食至少10 h，空腹組受試者空腹單次口服受試制劑或參比制劑，240 mL溫水送服。餐后組受試者于服藥當天早上07：30左右開始進食高脂高熱量早餐，要求須在30 min內進餐完畢。開始進餐后30 min準時單次口服受試制劑或參比制劑，240 mL溫水送服。服藥前1 h及服藥后1 h內禁止飲水，服藥后4 h內禁食，服藥后4、10 h統一進食標準午餐和晚餐。第一周期受試者服用受試制劑或參比制劑，則第二周服用參比制劑或受試制劑，過程與第一周期相同。

1.5 血樣采集及處理

每個周期于給藥前0 h（服藥前3 h內，視為0 h）和服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、16、24 h采集受試者前臂靜脈血4 mL置于EDTA-K2抗凝劑真空負壓采血管中，輕柔顛倒混勻5～6次，采集后即刻置于冰浴中，于1 h內在2～8 ℃、1 500～2 000 g離心10 min，分離出血漿分裝于2支凍存管中，1 mL分裝于檢測管中，剩余量分裝于備份管中，2 h內放置超低溫冰箱[（-70±10）℃]凍存，直至樣本轉運。轉運過程全程冷鏈監控（約-80 ℃）。

1.6 測定方法

1.6.1 測定條件 色譜條件：色譜柱為ACE 3 C18-AR （50 mm×2.1 mm）；流動相A為0.4%甲酸水溶液（pH 3.2）；流動相B為乙腈；梯度洗脫；柱溫為40 ℃；流速為0.4mL/min；自動進樣器溫度為4 ℃，進樣量2 μL。質譜條件采用正離子電噴霧離子化（ESI）電離模式，多反應監測模式（MRM）掃描模式?？肆置顾仉x子對m/ z 425.3→m/z 126.2，內標克林霉素-d3離子對m/ z 428.3→m/z 129.2，碰撞能量為40 eV。

1.6.2 樣本前處理 血漿樣本室溫完全融化后混勻30 s，取50 μL樣本置于96孔板中，加入20 μL 內標工作溶液（內標 500 ng/mL，甲醇∶水=1∶1）渦旋混勻，加入500 μL甲醇溶液，渦旋3 min，4 ℃、3 200 g離心5 min，取上清液50 μL至新的96孔板中，40 ℃氮氣吹干，加入250 μL復溶液[乙腈∶0.4%甲酸水溶液（pH3.2）為15∶85]渦旋3 min，LC-MS/MS進樣分析。

1.7 方法學驗證

在測定條件下，待測物克林霉素和內標保留時間均約為0.3 min，克林霉素和內標通道出峰保留時間處相互未見明顯干擾，高濃度進樣后未見明顯殘留。

空白血漿制備標準曲線濃度為：0.02、0.04、0.1、0.5、1.5、9、10 mg/L，進行前處理后進樣檢測得到克林霉素峰面積與內標峰面積之比和濃度線性回歸方程y=0.002 3x+ 0.002 4，R2=0.997 0。線性范圍為0.02～10 mg/L，定量下限為0.02 mg/L。

采用定量下限（LLOQ）、低（QCL）、中（QCM）、高（QCH）4個濃度血漿質控樣品（0.02、0.06、2、8 mg/L），每個濃度平行6份，批內準確度偏差為-8.5%～5.00%，批內變異系數≤6.99%。批間準確度偏差為-2.50%～0.75%，批間變異系數≤7.08%。

采用QCL、QCM、QCH血漿質控樣品，提取回收率分別為77.49%、83.03%、78.33%，變異系數為3.75%。內標平均提取回收率為82.43%，變異系數為4.45%。

QCL、QCH濃度質控樣品內標歸一化基質效應因子變異系數為5.85%、4.69%。脂血、溶血基質對待測物和內標測定無顯著影響。

待測物貯備液和工作液在-20 ℃條件下穩定59 d，在室溫避光條件下分別穩定22 h、21 h；內標工作液在室溫避光條件下穩定18 h；全血在黃光燈或日光燈下、室溫和冰浴條件下均穩定2 h；血漿基質樣品室溫下穩定24 h，4 ℃條件下穩定48 h，-20 ℃和-70 ℃條件下穩定59 d；前處理后的樣品在4 ℃條件下穩定193 h；血漿基質樣品在-20 ℃和-70 ℃條件下反復凍融5次后穩定。

方法學驗證及生物樣本測定由江蘇萬略醫藥科技有限公司完成。

1.8 藥動學參數計算及生物等效性判定

使用非房室模型方法，采用WinNonlin?6.4版軟件，計算藥動學參數，對主要藥動學參數（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞）進行自然對數轉換后，考慮周期效應、制劑效應、序列效應、受試者（隨序列）效應和殘差，以lnCmax、lnAUC0-t、lnAUC0-∞為因變量進行多因素方差分析，對Tmax進行非參數檢驗。以方差分析結果為基礎，采用90%CI分析法，當受試制劑與參比制劑藥動學參數AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的幾何均值比的90%CI均在80.00%～125.00%等效區間內，則認為兩制劑生物等效。

2 結果

2.1 受試者入組和完成情況

空腹組受試者和餐后組受試者全部完成試驗，均納入安全性分析集、藥動學參數集及生物等效性分析集?？崭菇o藥組共入組24名受試者，男14名，女10名，平均年齡為（26.2±3.6）歲，平均體重為（63.76±9.87）kg，平均體重指數（BMI）為（22.75±2.08）kg/m2，漢族21名，其他民族3名。餐后給藥組共入組24名受試者，男14名，女10名，平均年齡為（25.3±5.5）歲，平均體重為（60.32±7.56）kg，平均BMI為（22.17±1.92）kg/m2，漢族21名，其他民族3名。

2.2 血藥濃度-時間曲線

空腹組口服克林霉素受試制劑和參比制劑后平均血漿藥物濃度-時間曲線見圖1，餐后組口服受試制劑和參比制劑后平均血漿藥物濃度-時間曲線見圖2。無論空腹或餐后給藥，服用受試制劑和參比制劑后藥時曲線均相似。

2.3 藥動學參數

空腹和餐后口服克林霉素受試制劑和參比制劑后主要藥動學參數見表1?？崭菇M參比制劑的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞分別為3.64 mg/ L、0.75 h、12.70 h·mg/L、13.10 h·mg/L，受試制劑分別為3.55 mg/L、0.62 h、12.20 h·mg/ L、12.40 h·mg/ L。餐后組參比制劑的Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞分別為3.37 mg/L、2.00 h、15.20 h·mg/L、15.70 h·mg/L，受試制劑分別為3.37 mg/L、2.00 h、16.40 h·mg/L、17.00 h·mg/ L。

2.4 生物等效性評價

圖1 受試者空腹口服克林霉素后平均血漿藥物濃度-時間曲線Figure 1 Plasma concentration-time curves of clindamycin in subjects following oral administration under fasted state

圖2 受試者高脂餐條件下口服克林霉素后平均血漿藥物濃度-時間曲線Figure 2 Plasma concentration-time curves of clindamycin in subjects following oral administration under fed state

表1 受試者空腹或高脂餐后單次口服克林霉素膠囊受試制劑和參比制劑的主要藥動學參數Table 1 Mean pharmacokinetic parameters of clindamycin in healthy subjects after single dose administration of test and reference preparations under fasted or fed condition（mean ± SD）

健康受試者空腹口服克林霉素受試制劑和參比制劑后，主要藥動學參數Cmax、AUC0-∞、AUC0-t經對數轉換后幾何均值比分別為99.34%、97.84%、98.47%，進行方差分析和雙單側t檢驗，90%CI分別為91.94%～107.34%、90.60%～105.64%、91.28%～106.22%。經非參數秩和檢驗，Tmax差異無統計學意義（P＞ 0.05）。健康受試者高脂餐后口服受試制劑和參比制劑，主要藥動學參數Cmax、AUC0-∞、AUC0-t經對數轉換后幾何均值比分別為99.87%、106.28%、105.70%，進行方差分析和雙單側t檢驗，90%CI分別為91.53%～108.97%、98.28%～114.92%、97.81%～114.22%。經非參數秩和檢驗，Tmax差異無統計學意義（P＞0.05）。中國健康受試者空腹或餐后口服受試制劑和參比制劑后，Cmax、AUC0-∞、AUC0-t的幾何均值比90%CI均在80.00%～125.00%，因此兩制劑生物等效。

2.5 安全性評價

空腹和餐后給藥組所有受試者均進入安全性分析集。空腹服用參比制劑的24名受試者中7名發生了11例次不良事件，其中3例次不良事件與參比制劑可能有關，包括蕁麻疹、丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶升高。空腹服用受試制劑的24名受試者中8名發生了14例次不良事件，其中3例次不良事件與受試制劑可能有關，包括蕁麻疹、嘔吐和腹瀉。1例發生蕁麻疹不良事件的受試者采用爐甘石硫洗劑治療后恢復。3例次與受試制劑可能有關的不良事件轉歸均為恢復。餐后服用參比制劑的24名受試者中10名發生18例次不良事件，其中7例次不良事件與參比制劑可能有關，包括血白細胞計數降低、中性粒細胞絕對值降低、中性粒細胞百分比降低、淋巴細胞百分比升高、頭暈和頭昏。餐后服用受試制劑的24名受試者中5名發生了7例次不良事件，其中2例次不良事件與受試制劑可能有關，包括頭暈和中性粒細胞絕對值降低。所有不良事件均為輕度、一過性，除1名受試者發生蕁麻疹，使用爐甘石硫洗劑治療后恢復外均未經治療自行恢復。試驗中未發生嚴重不良事件，未發生導致退出的不良事件。

3 討論

克林霉素是臨床常用抗生素，抗菌譜與林可霉素相同，但抗菌活性強于林可霉素，口服吸收快速完全，組織穿透性良好，臨床上廣泛用于敏感革蘭陽性球菌和厭氧菌引起的感染。本研究中中國健康受試者單次空腹口服鹽酸克林霉素膠囊300 mg受試制劑和300 mg參比制劑后快速吸收，受試制劑和參比制劑Tmax中位數為0.62 h（0.50～1.51 h）、0.75 h（0.50～2.50 h），平均半衰期分別為3.09 h和4.06 h；餐后口服受試制劑和參比制劑后Tmax中位數為2.00 h（0.75～5.00 h）、2.00 h（0.75～4.00 h），平均半衰期分別為5.20 h和3.72 h。進餐使口服吸收略延緩，藥物暴露量略增加（AUC增加約20%～30%），Cmax無影響。健康受試者服用受試制劑和參比制劑后發生的與研究藥物相關的不良事件發生率相似，主要包括嘔吐、腹瀉、蕁麻疹和輕度、一過性的肝酶異常和血常規異常，所有不良事件均未超出說明書。

對于骨髓炎成年患者的臨床治療方案為600 mg，1次/ 8 h口服或靜脈給藥。由于體外甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為0.125 mg/L[7]，文獻報道克林霉素骨穿透率約為30%[8]，克林霉素骨濃度與MIC之比達到5時可預期達到良好微生物學療效[9]。因此血漿最低濃度達到2 mg/ L預期可達到良好微生物學療效。根據本研究中300 mg劑量下暴露量，推測600 mg，1 次 /8 h口服給藥時血藥濃度接近50%時間將持續高于2 mg/L，預期可達良好療效。

兩制劑在餐后和空腹給藥后藥時曲線非常相似，發生的不良事件及發生率均相似。經生物等效性評價，兩制劑生物等效。