miR-155-5p靶向核因子κB抑制蛋白E在人單核巨噬細胞抗新生隱球菌免疫反應中的機制研究

王一霖， 滕 亮， 王中志， 王 妍， 林文婷， 陳江漢

新生隱球菌是一種環境致病菌，可以感染人類和許多哺乳動物的肺、皮膚、骨骼等全身各器官，但以侵犯中樞神經系統最常見（即為隱球菌性腦膜炎）。據估計，僅2014年就新增223 100例隱球菌性腦膜炎病例，其中73%發生在非洲[1]。與歐美、非洲等地區隱球菌性腦膜炎主要發生在AIDS人群不同，我國主要發生在非AIDS的無免疫功能缺陷的人群，但在治療上卻比免疫功能受損的患者療程更長，治療更困難[2]。隱球菌性腦膜炎患者如不及時治療，86%在1年內死亡，即使現代醫療的情況下，病死率仍有20%～30%[3]。因此，如何有效防治新生隱球菌中樞神經系統感染，是目前亟需解決的問題。

微小RNA（miRNA）是一類長度約為20～24個核苷酸非編碼小RNA分子，主要在轉錄后水平調節靶基因表達，參與細胞分化、信號轉導、免疫應答、腫瘤發生等多種生命活動。miR-155-5p參與免疫細胞的發育分化，在活化的巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和樹突狀細胞中表達明顯增加，并在免疫應答中發揮重要作用[4-5]。核因子κB抑制蛋白E（IKBKE）是IκB激酶家族（IKKs）新近發現的成員，可通過調節核轉錄因子-κB（NF-κB）信號轉導途徑，在固有免疫系統中發揮重要作用[6]。通過前期mirnada網站預測，發現miR-155-5p和IKBKE基因有結合位點，而miR-155-5p和IKBKE基因均參與細胞炎性反應，因此猜測miR-155-5p通過靶向降解IKBKE信使RNA（mRNA）在人單核巨噬細胞（THP-1細胞）抗新生隱球菌免疫反應中發揮著作 用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細胞購于中國科學院細胞庫；新生隱球菌標準株WM148來自上海長征醫院皮膚科真菌儲藏室；胎牛血清購自Gibco公司，細胞培養基RPMI-1640、Opti-MEM培養基及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone；腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細胞介素（IL）-6 Elisa試劑盒來自中國欣博盛生物科技公司；異丙醇、三氯甲烷和無水乙醇來自鼎國生物技術有限公司；miR-155-5p mimics、IBKEK siRNA購自中國銳博生物公司；miR-155-5p、U6引物購自上海生工生物工程公司；反轉錄試劑盒和Trizol購自TaKaRa公司；實時熒光PCR試劑盒購自ABM公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；X-tremegene HP購自羅氏公司；佛波酯（PMA）購自SIGMA公司；脂質體2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞、菌株培養 THP-1細胞培養于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中；2～3 d換液1次，細胞密度達80%時傳代培養。WM-148標準株培養于YEPD培養基（2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物）中，30 ℃培養，收集菌株予0.9% NaCl溶液沖洗2遍后65 ℃條件下滅活1 h，計數并調整菌液濃度。

1.2.2 細胞分組、干預及收集樣品 將濃度為1×106/mL的THP-1細胞液2 mL接種于6孔板，每孔加入200 ng PMA，48 h誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞，按照菌與細胞5∶1數量比加入已滅活的新生隱球菌進行干預，在0 h、3 h、6 h、9 h和12 h時間點離心收集細胞及上清液，保存于-80 ℃冰 箱。

1.2.3 反轉錄合成cDNA及qPCR檢測 Trizol法提取總RNA后，利用紫外分光光度計將RNA濃度調整至500 ng/μL左右，miR-155-5p反轉錄10 μL體系（mRQ緩沖液5 μL、mRQ酶混合物1.25 μL及RNA樣品3.75 μL），反應條件為37 ℃ 1 h、85 ℃5 min；IKBKE反轉錄10 μL體系（5×PrimeScript RT預混合溶液2 μL、RNA樣品500 ng、無酶水加至10 μL），反應條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s；miR-155-5p及U6實時熒光PCR 25 μL體系[無酶水9.5 μL、SYBR 12.5 μL、MRQ 3'引物0.5 μL（U6上游引物）、miRNA引物0.5 μL（U6下游引物）、cDNA 2 μL]，反應步驟為：①95 ℃ 5 min，②95 ℃ 10 s，③63 ℃ 15 s，④72 ℃ 5 s（步驟②～④重復40個循環），進行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。引物見表1。

1.2.4 檢測上清液TNF-α和IL-6含量 利用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測，按照試劑盒操作步驟進行操作，于分光光度計450 nm處檢測各組吸光值。根據標準品線性回歸方程計算各組細胞因子的濃度。

表1 qRT-PCR引物信息表Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR in this study

1.2.5 驗證miR-155-5p與IKBKE基因的靶向關系 將實驗分為6組，分別是海腎熒光素酶（pRL）質粒+模擬物（mimics）陰性對照（NC）、pRL質粒+miR-155-5p、pRL質粒+IKBKE 3'UTR+mimicsNC、pRL質粒+IKBKE 3'UTR+ miR-155-5p、pRL質粒+IKBKE 3'UTR-突變型（mut）+mimicsNC、pRL質粒+IKBKE 3'UTR-mut+miR-155-5p。將生長良好的細胞分入24孔培養板培養，按實驗設計的組別進行質粒轉染實驗。轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光標記基因的表達情況，然后使用“Dual-Luciferase?Reporter Assay System（E1910，promega）”試劑盒處理細胞、進行熒光素酶表達檢測。

1.2.6 IKBKE siRNA的轉染 將實驗分為空白對照組和轉染IKBKE siRNA組，用不含抗生素和血清的培養基稀釋IKBKE siRNA后，將其加入生長良好的細胞中，轉染6 h后測定IKBKE、TNF-α和IL-6的表達變化。

1.2.7 miR-155-5p mimics的轉染 更換細胞液，調整好細胞生長的狀態；將實驗分為4組，分別是0 h對照組、6 h對照組、0 h mimics組、6 h mimics組，用脂質體2000試劑盒，按照試劑盒操作步驟進行操作，實驗組轉染miR-155- 5p mimics，對照組轉染miR-155-5p mimics對照物，檢測轉染效率，提取RNA和上清液進行下一步實 驗。

1.2.8 統計學方法 根據SPSS 19.0統計軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差表示，兩組樣本均數的比較采用t檢驗，各組間的兩兩差異比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-155-5p、IKBKE、TNF-α和IL-6在新生隱球菌誘導THP-1細胞后的表達變化

新生隱球菌誘導THP-1細胞后，以0 h為對照，miR-155-5p在3 h、6 h、9 h、12 h表達量均升高，其中在6 h升高最為顯著（P＜0.01），隨后逐漸下降；IKBKE在3 h、6 h、9 h下降量與0 h比較差異有統計學意義，其中在6 h下降最顯著（P＜0.01），TNF-α和IL-6表達逐漸增加，其中TNF-α在9 h達到峰值。見圖1。

2.2 雙熒光素酶報告系統驗證miR-155--55pp和IKBKE 3'非翻譯區（3' UTR）區域的相互作用

根據mirnada網站預測結果，miR-155-5p和IKBKE基因有結合位點（圖2A）。雙熒光素酶報告系統進一步驗證了這一點：miR-155-5p作用后IKBKE 3'UTR活性下降了30%，說明miR-155-5p能夠作用IKBKE 3'UTR區域，引起IKBKE 3'UTR活性下降；將IKBKE 3'UTR進行突變后，IKBKE 3'UTR-mut活性較野生型增加15%，而與對照組相比差異無統計學意義（圖2B），說明突變位點對miR-155-5p的結合很重要，可能是其相互結合的位點。見圖2。

2.3 miR-155-5p通過調控IKBKE進一步調節THP-1細胞的功能

經轉染miR-155-5p mimics，miR-155-5p實驗組較對照組在6 h表達明顯增加，證明轉染效率較高，相對應IKBKE基因6 h實驗組較6 h對照組表達下降，進一步驗證了miR-155-5p與IKBKE的靶向關系；檢測上清液因子發現實驗組 TNF-α和IL-6在6 h表達均較對照組增加，表明miR-155-5p表達增加促進了THP-1細胞中TNF-α和IL-6的表達。見圖 3。

圖1 新生隱球菌誘導后miR-155-5p和IKBKE的表達倍數變化以及TNF-α和IL-6的表達量變化Figure 1 Fold change of miR-155-5p expression and IKBK expression，TNF-α expression and IL-6 expression at different time points after induction by C. neoformans

圖2 miR-155-5p和IKBKE基因的結合位點（A）及雙熒光素酶報告系統中IKBKE 3'UTR和IKBKE 3'UTR-mut的活性變化（B）Figure 2 Binding site of miR-155-5p and IKBKE（Panel A）， activity change of IKBKE 3'UTR and IKBKE 3'UTR-mut in the dual luciferase reporter system（Panel B）

2.4 IKBKE siRNA轉染THP-1細胞后TNF-α和ILL--66的表達變化

經轉染IKBKE siRNA，IKBKE含量在6 h下降，表明轉染效率較高，而TNF-α和IL-6在6 h表達增加，表明經抑制IKBKE能夠促進TNF-α和IL-6的表達。見圖4。

3 討論

發生在我國免疫正常人群的隱球菌性腦膜炎病原菌多為新生隱球菌，該病病情兇險，病死率高，療程長，治療費用高，對患者和社會都是沉重的負擔，迫切需要對其發病機制及治療手段進行研究[2]。

THP-1細胞是人體固有免疫系統的重要組成部分，在外界因素刺激下可被激活為經典激活巨噬細胞（M1型）和替代激活巨噬細胞（M2型）：M1型細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，具有很強的殺菌作用；M2型巨噬細胞分泌轉化生長因（TGF）-β、精氨酸酶1（Arg1）、IL-10等炎性因子，可抑制炎性反應[7]。在新生隱球菌性腦膜炎患者中，M1型細胞有助于清除病原體，而M2型細胞介導免疫逃逸[8]，因此促進THP-1細胞向M1型極化有助于治療隱球菌性腦膜 炎。

圖3 轉染miR-155-5p mimics及其對照物后，miR-155-5p和IKBKE的表達倍數變化及TNF-α和IL-6的表達量變化Figure 3 After transfection of miR-155-5p mimics and its controls， the fold change of expression of miR-155-5p and IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

圖4 轉染IKBKE siRNA及其對照物后IKBKE的表達倍數變化及TNF-α和IL-6的表達量變化Figure 4 After transfection of IKBKE siRNA and its controls， the fold change of expression of IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

通過研究新生隱球菌干預THP-1細胞發現，miR-155-5p在6 h時間點表達增加，同時炎性因子TNF-α、IL-6表達明顯增加，而IKBKE基因在6 h表達減少，因此推測miR-155-5p通過靶向降解IKBKE mRNA促進TNF-α和IL-6的表達。之后通過雙熒光素酶報告系統發現在miR- 155- 5p mimics作用下，IKBKE 3'UTR活性下降，將3'UTR突變其活性再次增加，證實miR-155-5p可與IKBKE 3'UTR結合。隨后我們對miR-155-5p功能進行了研究，在miR-155-5p mimics作用下，與對照組比較，實驗組在6 h時IKBKE表達降低，TNF-α和IL-6表達明顯增加，表明miR-155-5p促進TNF-α、IL-6的表達。為了驗證miR-155-5p通過靶向調控IKBKE發揮了此作用，我們將IKBKE siRNA轉染至THP-1細胞中，發現在6 h時IKBKE表達減少，同時TNF-α和IL-6表達增加。

綜上所述，本研究顯示并驗證了miR-155-5p通過靶向降解IKBKE mRNA促進TNF-α和IL-6的表達這一調控機制。根據已知研究結果可知TNF-α和IL-6是M1型巨噬細胞分泌的炎性因子，該細胞為促炎類型的巨噬細胞，具有強效殺菌特點并促進輔助性T細胞1型參與的免疫反應（Th1型免疫反應），其在隱球菌性腦膜炎病程中發揮抗感染殺菌作用[5]。因此miR-155-5p可作為隱球菌性腦膜炎潛在的治療靶點，在臨床實踐中發揮重要作用。盡管發現IKBKE在隱球菌干預THP-1細胞反應中發揮重要作用，但其作用的炎癥通路和具體分子機制仍然不清楚，需要進一步探索和研究。