十二份柑橘種質對褐斑病的抗性評價

楊蕾　洪林　程昌鳳　李勛蘭　趙倩　譚平

摘? ?要? ?柑橘褐斑病是一種為害嚴重的真菌性病害。為了探討重慶地區優新柑橘種質對柑橘褐斑病菌（Alternaria alternate）的敏感程度及抗性分級標準，本研究采用室內離體柑橘葉片刺傷接種觀察不同柑橘種質的感病情況，并根據系統聚類分析法、病斑平均直徑法、病情指數法3種評價方法對其抗病性進行分級。結果表明，十二份柑橘種質資源中含高抗品種4個、抗病品種3個、中抗品種2個、感病品種2個、高感品種1個，未發現免疫種質。98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈為高抗品種。建議在生產中可根據需求適當擴大種植面積;塔羅科血橙為高感品種，要對其加強褐斑病的檢測與防控，同時可用抗病新品種麗朵血橙進行替換。

關鍵詞? ?柑橘種質;柑橘褐斑病菌;抗性

中圖分類號：S436.661? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.22.003

重慶三峽庫區是國家農業部《全國柑橘優勢區域發展規劃》長江中上游柑橘產業帶的核心區。截至2017年底，重慶市柑橘栽培面積達21.33萬公頃，產量超過300萬噸，綜合產值約300億元。柑橘產業已成為重慶地區打贏脫貧攻堅戰、實現鄉村振興的支柱產業之一。

柑橘褐斑病是由交鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的一種嚴重為害柑橘嫩葉、嫩梢和果實的真菌性病害[1]。其主要病癥表現為病斑中心呈褐色或者黑褐色，邊緣有淡黃色暈圈包圍。該病最早于1903年在澳大利亞柑橘品種“皇帝柑”上發現并報道，此后在世界多個柑橘主產國的各種柑橘均發現受到該病為害[2]。我國于2010年開始有相關報道[3]，隨后報道發生面積和為害程度不斷擴增[4-5]。劉弘等調查了2010年重慶萬州地區紅橘褐斑病的發生情況，發現發病嚴重的果園發病率達100%、病果率超過80%，嚴重影響紅橘的產量及品質[6]。Alternaria alternata可以代謝產生毒素ACT[7]，對活性氧（ROS）的高效解毒[8]成為其侵染柑橘的必要條件，病原菌入侵后會影響柑橘防御酶系統的變化[9]。

柑橘品種雜亂，對各品種間的生態適應性及品質特征等缺乏統一評價標準，因此重慶市農業委員會從2011年底開始在7個柑橘主產區縣建立了市級柑橘品種區域試驗（簡稱區試）基地，并于2013年出臺了《柑橘品種區域試驗管理辦法》，目前區試基地已接收到20余個參試柑橘品種[10]。經過3年的區試試驗，已確認一批生產性能良好、品質佳的優新柑橘品種，而對于這些優新品種抗柑橘褐斑病的能力尚未做評價。本文以重慶地區十二個柑橘優新品種為試驗對象，以交鏈格孢菌為指示菌株，通過3種不同的抗病性測定方法，綜合測評各品種抵抗柑橘褐斑病的能力，以期為重慶市柑橘產業發展后續品種儲備及良種推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

病原菌：柑橘褐斑病菌（Alternaria alternata）由西南大學柑橘研究所植保室分離純化保存。菌種在PDA培養基上25 ℃光照培養7 d以活化備用。

供試柑橘種質十二份，均采自重慶市柑橘品種區域試驗平臺江津區試點。供試品種為98-1長葉橙、94-1長葉橙、青秋臍橙、塔羅科血橙、麗朵血橙、津香橙、金塊、薩斯塔金、泰浩金、探戈、優山美地金和W·默科特等，是在近3年的重慶柑橘區域品比試驗中生產性能表現良好的優新柑橘品種。

柑橘葉片樣品采集方法為：每個品種選擇3株樣樹采集葉片，每株樹選東南西北4個方向新梢各3枝，每枝上采5片新葉，每個品種共采集新葉180片。采用10針刺傷接種法，每片離體新葉片接種1個直徑4 mm致病菌菌餅。接種后將葉片置于25 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕生化培養箱中進行光照黑暗交替培養，光照12 h，黑暗12 h。每天觀察接種葉片上的病斑發展狀況，在培養2 d后，將接種的病菌挑去，分別在4 d、6 d、8 d、10 d測量計算病斑面積或直徑及發病率。

1.2 抗病性評價方法

1.2.1 病情指數法

參考《柑橘種質資源描述規范和數據標準》中柑橘瘡痂病抗性標準[11]，對柑橘褐斑病抗性進行分級。病情等級分級標準見表1。

種質群體對柑橘褐斑病的抗性依病情指數分為6級（見表2）。

1.2.2 病斑直徑法

病斑平均直徑法（以下簡稱AD法）：

AD=∑發病葉片病斑直徑/調查葉片數。抗性分級標準：免疫（I）為 AD=0 mm;高抗（HR）為

0 mm14 mm。

1.2.3 系統聚類分析法

參考陳紅梅等對鐮刀菌干腐病抗性評價分析的方法[12]，依據平均病斑直徑、病情指數、發病率3項參數，采用SPSS 20.0軟件對不同處理方法、聚類距離和聚類方法的組合進行數據分析，篩選出最合適的系統聚類分析方法。

2 結果與分析

2.1 不同柑橘品種褐斑病的發病規律

從表3可以看出，接種柑橘褐斑病菌后，隨著作用時間延長發病率逐漸增高。接種后第4天發病率均較低，第6天發病率有較大幅度提高，第8天發病率的增長幅度較小，第10天時發病率達到最大;98-1長葉橙在接種病菌第4天時發病率最低，為0%，塔羅科血橙在接種病菌第10天時發病率最高，為66.22%。

從不同品種的病斑直徑來看，總體規律與發病率規律相似，即隨著病菌侵入時間延長病斑直徑逐漸增加。接種后第4天，甜橙類的98-1長葉橙、青秋臍橙和雜柑類的薩斯塔金平均病斑直徑幾乎為0。接種后第10天，雜柑類的探戈病斑直徑最小，為1.40 mm，甜橙類的塔羅科血橙病斑直徑最大，為18.77 mm。

2.2 不同柑橘品種褐斑病的病情指數特征

試驗結果表明，不同柑橘品種被褐斑病菌侵染后的病情指數動態各不相同。總體上，塔羅科血橙第10天的 DI最高，98-1長葉橙第4天的 DI最低。從 DI的增長幅度來看，青秋臍橙的變化幅度最大，W·默科特的變化幅度最小。從病情發展與侵染時間的規律來看，接種后第6天至第10天發病嚴重程度快速增加（見表4）。

2.3 對十二份柑橘種質資源抗性的綜合評價

3種評價方法均可將十二份柑橘屬種質劃分為高抗、抗、中抗、感病、高感5類（見表5）。在病斑平均直徑法中，高抗品種有4個，即98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈;中抗病種有2個，即94-1長葉橙、青秋臍橙;抗病品種有3個，即麗朵血橙、金塊和優山美地金;感病品種有1個，即泰浩金;高感品種有2個，即塔羅科血橙和W·默科特。在病情指數法中，高抗品種有3個，即98-1長葉橙、薩斯塔金、探戈;抗病品種有4個，即麗朵血橙、津香橙、金塊和優山美地金;中抗病種有1個，即青秋臍橙;感病品種有3個，即94-1長葉橙、泰浩金和W·默科特;高感品種有1個，即塔羅科血橙。采用系統聚類分析法時，病斑直徑原始數值不轉換，聚類距離采用歐式距離，聚類方法采用最長距離法后，所得聚類效果與接種結果吻合度最好。據此，以歐式距離7.0作為聚類分割點對十二份優新柑橘種質褐斑病抗性進行劃分，結果（圖1）為：高抗品種4個，即98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈;抗病品種3個，即麗朵血橙、金塊和優山美地金;中抗品種2個，即94-1長葉橙和青秋臍橙;感病品種2個，即泰浩金和W·默科特;高感品種1個，即塔羅科血橙。綜合比較3種評價方法發現，大部分品種的抗性評價結果相同，僅少數幾個品種略有差異。94-1長葉橙在系統聚類分析法及病斑平均直徑法中為中抗品種，而在病情指數法中為感病品種;津香橙在系統聚類分析法及病斑平均直徑法中為高抗品種，而在病情指數法中為抗性品種;W·默科特在系統聚類分析法及病情指數法中為感病品種，而在病斑平均直徑法中為高感品種。

3 討論

本研究中采用3 種分析方法對抗病性進行分級，供試的十二份柑橘屬種質可劃分為高抗、抗、中抗、感和高感5類，未發現免疫種質。高抗種質有4種，包括98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金和探戈;高感種質有1種，為塔羅科血橙。在本試驗結果中W·默科特為感病或是高感品種，這與Peever等[13]、Reis等[14]和胡軍華等[15]的研究結果（中抗）不一致;塔羅科血橙為高感品種，這一結論與陳紅梅等[12]的研究結果不一致。導致這些差異的原因可能是試驗中病原菌的致病能力不同、種質資源生長環境存在差異及植株自身的變異等。

對四大類柑橘種質進行褐斑病感病性分析發現，分屬不同類型的十二個柑橘品種的感病性能和類別無關。如同屬甜橙類的98-1長葉香橙和94-1長葉香橙、塔羅科血橙和麗朵血橙，其病菌侵入后的響應時間、發病率和病情指數等發病特征均存在極顯著的差異。而同為引種自美國的5個雜柑品種金塊、薩斯塔金、泰浩金、探戈和優山美地金，對褐斑病的抗性水平差異也很明顯。由重慶市農業科學院果樹研究所自主選育的新品種津香橙，對褐斑病表現出良好的抗性，抗性綜合評價水平達到了高抗或是抗病，體現了良好的雜種優勢和適應性。

根據本研究結果，建議在柑橘褐斑病的流行區域，如萬州等柑橘主產區，種植98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈等高抗品種，可以用生產性能和品質更為優良的探戈替代現有品種W·默科特;針對高感病品種，應加強柑橘褐斑病的監測和綜合防控，控制塔羅科血橙種植面積并用優良抗病新品種麗朵血橙進行替換。

參考文獻：

[1] Canihos Y， Peever TL， Timmer LW. Temperature， leaf etness， and isolate effects on infection of Minneola tangelo leaves by Alternaria sp[J]. Plant Disease， 1999， 83（5）： 429-433.

[2] Cuenca J， Aleza P， Vicent A. Genetically based location from triploid populations and gene ontology of a 3.3-Mb genome region linked to alternaria brown spot resistance in citrus reveal clusters of resistance genes[J]. Plos One， 2013， 8（10）：1-18.

[3] 張玉潔，楊續旺，張志信，等.柑橘褐斑病的病原分離和藥物篩選[J].北方園藝，2010（14）：169-171.

[4] 陳昌勝，黃峰，程蘭，等.紅橘褐斑病病原鑒定[J].植物病理學報，2011，41（5）：449-455.

[5] 黃峰，朱麗，李紅葉.甌柑褐斑病的病原鑒定[J].浙江農業科學，2012（9）：1281-1282.

[6] 劉弘，程蘭，卿勵，等.重慶萬州紅橘褐斑類病害病原菌的分離鑒定及抑菌藥劑篩選[J].西南大學學報（自然科學版），2011，33（12）：33-38.

[7] Akimitsu K， Peever TL， Timmer L. Molecular， ecological and evolutionary approaches to understanding Alternaria diseases of citrus[J]. Molucelar Plant Pathology， 2003， 4 （6）：435-446.

[8] 張倩，唐飛艷，孔向雯，等.柑橘褐斑病菌信號轉導基因及活性氧解毒機制研究進展[J].園藝學報，2016，43 （9）：1699-1710.

[9] 龍艷玲，蘇基平，胡軍華，等.柑橘褐斑病菌對不同抗性柑橘品種防御酶活性的影響[J].中國南方果樹，2018，47（1）：6-11.

[10] 洪林，楊蕾，李勛蘭，等.重慶市柑橘產業發展現狀與主要成效[J].南方農業，2018，12（19）：78-80.

[11] 江東，龔桂芝.柑橘種質資源描述規范和數據標準[M].北京：中國農業出版社，2006：77-79.

[12] 陳紅梅，李金花，柴兆祥.35個馬鈴薯品種對鐮刀菌干腐病優勢病原的抗性評價[J].植物保護學報，2012，39（4）：308-314.

[13] Peever TL， Olsen L， Iba′Niez A， et al. Genetic differentiation and host specificity among populations of Alternaria spp. causing brown spot of grapefruit and tangerine grapefruit hybrids in Florida[J]. Phytopathology， 2000， 90（4）：407-414.

[14] Reis RF， Almeida TFD， Stuchi ES， et al. Susceptibility of citus species to Alternaria alternate， the causal agent of the alternaria brown spot[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 113（4）：336-342.

[15] 胡軍華，劉榮萍，王雪蓮，等.不同柑橘屬種質對柑橘褐斑病菌的抗性評價[J].果樹學報，2015，32（4）：672-680.

（責任編輯：丁志祥）