基因治療中的穿膜肽轉(zhuǎn)染機(jī)制

王鶴

【摘 要】基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療疾病的目的。基 因治療 的策略主要包括：對(duì)有缺 陷的基因進(jìn)行修復(fù)，或者用正常的基 因替換致病基因 ， 糾正人 自身基 因功能和表達(dá) 的紊 亂 二 通過反義技術(shù)及RNA干擾技術(shù)抑制 有害基 因的表達(dá) 三 利用導(dǎo)入的外來基 因的表達(dá)產(chǎn)物 ， 彌補(bǔ)缺陷細(xì)胞 的功能等 約有 70%的基因治療臨床試 驗(yàn)應(yīng)用的是病毒載體，相比之下，非病毒型基因載體穿膜肽免疫原性較低，且價(jià)格低廉，易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，是目前被廣泛研究的一種基因載體。

【關(guān)鍵詞】基因治療;穿膜肽載體

一、引言

約有 70%的基因治療臨床試 驗(yàn)應(yīng)用的是病毒載體但病毒 載體 的應(yīng)用 仍然受到如 下 因素 的限制 制備 困難 、 目的基 因容量小 、靶 向特異性差 、 免疫原性較強(qiáng) 、易產(chǎn)生野 生型病毒等 。同時(shí) ， 在細(xì)胞水平 ， 病毒轉(zhuǎn)染后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)志的明顯改變 ， 致使再次應(yīng)用該類細(xì)胞的可能性降低 。尤其是在早年美 國(guó)發(fā)生 了一起 因腺病毒介 導(dǎo)基 因治療鳥氨酸氨 甲酞轉(zhuǎn)移酶缺 陷癥 引起免疫并發(fā)癥死亡 的案例后所以從安全醫(yī)用的角度考慮還是不宜用于基因治療。相比之下，非病毒型基因載體免疫原性較低，且價(jià)格低廉，易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，是目前被廣泛研究的一種基因載體。

二、穿膜肽載體的作用機(jī)制

穿膜肽載體被廣泛用于遞送DNA、mRNA和雙鏈RNA這些帶有大量負(fù)電荷的水溶性大分子與各種載體結(jié)合，經(jīng)過共價(jià)鍵連接、包裹或通過靜電相互作用結(jié)合成納米顆粒等方式負(fù)載在非病毒載體上，通常形成載體/核酸復(fù)合物直徑在幾十到幾百納米不等。這些納米復(fù)合物的理化性質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有較大影響非病毒載體/核酸復(fù)合物經(jīng)靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)，首先面臨的挑戰(zhàn)是在血液和細(xì)胞外間質(zhì)中各種核酸內(nèi)切酶降解。因此，非病毒載體負(fù)載核酸需要能夠保護(hù)其不被酶降解非病毒載體/核酸復(fù)合物經(jīng)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，被包裹于內(nèi)涵體（endosome）中，ATP介導(dǎo)的質(zhì)子泵作用使內(nèi)涵體和溶酶體中積累了大量的質(zhì)子，呈現(xiàn)明顯的酸性非病毒載體需要介導(dǎo)核酸分子逃逸出內(nèi)涵體，避免在內(nèi)涵體和溶酶體中降解。復(fù)合物在內(nèi)涵體中解離后基因游離到胞漿中，進(jìn)而通過胞核孔進(jìn)入核中進(jìn)行表達(dá)，最后轉(zhuǎn)錄得到蛋白質(zhì)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞及組織生長(zhǎng)。

三、穿膜肽載體轉(zhuǎn)染研究進(jìn)展

1.迄今發(fā)現(xiàn)，非病毒載體實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的機(jī)制有兩種：一種是質(zhì)子海綿膨脹機(jī)制，利用內(nèi)涵體內(nèi)部的酸性條件，在轉(zhuǎn)染過程中加入具有 pH緩沖作用的分子，使內(nèi)涵體不斷吸收質(zhì)子，最終漲破導(dǎo)致基因/載體復(fù)合物逃逸經(jīng)典的聚合物誘導(dǎo)的質(zhì)子海綿效應(yīng)其中核酸釋放依賴于通過聚合物和內(nèi)部?jī)?nèi)體膜的緊密結(jié)合的時(shí)間依賴性質(zhì)子化誘導(dǎo)的膜透化另一種內(nèi)涵體逃逸機(jī)制是借鑒病毒和細(xì)菌逃逸內(nèi)涵體的原理，利用疏水性基團(tuán)、雙親性結(jié)構(gòu)分子與磷脂雙層膜融合、打孔或裂解等方式實(shí)現(xiàn)。

2.反轉(zhuǎn)膠束模型中，堿性殘基會(huì)與質(zhì)膜中帶負(fù)電荷的磷脂之間相互作用，隨后疏水性殘基與膜核心的相互作用誘導(dǎo)雙分子層的擾動(dòng)，形成負(fù)曲率伴隨相鄰脂質(zhì)的重組形成反轉(zhuǎn)膠束進(jìn)而將肽包埋在內(nèi)部，膜破裂釋放肽進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)側(cè)。認(rèn)為經(jīng)典的脂質(zhì)混合機(jī)制通過脂質(zhì)復(fù)合物和宿主內(nèi)體膜的膜融合進(jìn)行，然后將帶負(fù)電荷的磷脂從細(xì)胞質(zhì)交換到內(nèi)體的內(nèi)表面。結(jié)果發(fā)生膜去穩(wěn)定化和核酸釋放。相反，脂質(zhì)混合可以起作用一種改變的機(jī)制，其中靠近內(nèi)-內(nèi)膜的脂質(zhì)復(fù)合物通過擴(kuò)散或降解失去脂質(zhì)分子。脂質(zhì)分子的釋放允許核酸的被動(dòng)釋放，隨后是由釋放的脂質(zhì)的整合導(dǎo)致的瞬時(shí)孔形成介導(dǎo)的隨后的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.所有這些模型的第一步都需要帶正電荷的CPPs與帶負(fù)電荷組分（如硫酸乙酰肝素HS和磷脂雙層）的細(xì)胞膜相互作用，使CPPs與脂質(zhì)雙分子層綁定然后導(dǎo)致質(zhì)膜的暫時(shí)不穩(wěn)定，陽(yáng)離子透膜肽介導(dǎo)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞的過程如圖12所示，陽(yáng)離子透膜肽與細(xì)胞膜外帶負(fù)電荷的糖胺聚糖（GAG）基質(zhì)如肝素等結(jié)合，小部分直接轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，絕大部分插入到細(xì)胞膜經(jīng)各種蛋白（如小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白）介導(dǎo)的內(nèi)吞或大包吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

4.小分子-CPP綴合物中的接頭的實(shí)例。用于小分子CPP的穩(wěn)定接頭包括硫醚鍵，其通過使用馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán)實(shí)現(xiàn)，三唑接頭通，和酰胺鍵使用碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺酯。可裂解酶包括在酸性pH下裂解的那些，例如通過醛與酰肼反應(yīng)獲得的腙鍵，和通過檸康酐與胺反應(yīng)獲得的順式酰胺連接子。還使用在還原條件下裂解的兩種硫醇之間形成的二硫化物接頭針對(duì)CPP-藥物遞送系統(tǒng)的掩蔽策略的實(shí)例由于它們的高陽(yáng)離子電荷，CPP是非特異性的內(nèi)化于許多類型的細(xì)胞和組織中。當(dāng)與其他主動(dòng)定向方法結(jié)合使用時(shí)，這種非特異性分布可能會(huì)超過目標(biāo)識(shí)別。克服這個(gè)問題的一種方法是屏蔽CPP直到復(fù)何物到達(dá)的目標(biāo)站點(diǎn)寡聚精氨酸的陽(yáng)離子電荷通過蛋白酶敏感肽序列或過氧化氫敏感基團(tuán)與低聚谷氨酸的連接而被掩蓋裂解后，寡精氨酸和低聚谷氨酸解離，顯示出低聚精氨酸的陽(yáng)離子電荷或者通過與組氨酸-谷氨酸共聚物序列連接掩蔽CPP的陽(yáng)離子電荷。

四、結(jié)論

透膜肽/核酸復(fù)合物的尺寸對(duì)細(xì)胞透膜機(jī)制有較大影響，部分較小尺寸的復(fù)合物可以直接轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而隨著復(fù)合物尺寸的增大，小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和大包吞作用呈逐漸增多趨勢(shì)通過球蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將直徑約120nm的納米顆粒內(nèi)化到細(xì)胞中，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)部化50-70nm的顆粒。通過肌動(dòng)蛋白對(duì)較大的顆粒被大胞飲作用內(nèi)化。

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