桑黃黃酮、多糖高產優良菌株的篩選試驗

謝春芹 楊鶴同 吳琴燕

摘要：為了篩選出黃酮和多糖產量較高的優良桑黃菌株，對17株桑黃菌株的生物量、黃酮和多糖含量及總產量進行分析，采用酵母提取物麥芽糖完全培養基（CYM）液體培養基對17株不同的桑黃菌株發酵培養7 d，收集液體菌絲，烘干至恒質量后測定菌絲干質量，用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定菌絲黃酮含量，用苯酚-硫酸法測定菌絲多糖含量。結果表明：在17株桑黃菌株中，生物量最大的是JNSH-14，達到0.645 g/100 mL;黃酮產量最大的是JNSH-15，達到42.048 mg/L;多糖產量最大的是JNSH-15，達到834.146 mg/L。由研究結果可以看出，JNSH-15菌株無論是在生物量還是總黃酮、總多糖產量方面，都處于較高水平。研究結果可為下一步桑黃黃酮、多糖發酵工藝優化中發酵菌株的選擇提供參考依據。

關鍵詞：桑黃;黃酮;多糖;菌株

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0209-04

桑黃（Phellinus spp.）在分類學上屬于真核真菌亞界（Eukaryomycota）真菌門（Eumycota）擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）多孔菌目（Polyporales）銹革孔菌科（Hymenochaetacae）針層孔菌屬（Phellinus）[1]，在我國有著悠久的應用歷史，最早在李時珍所著的《本草綱目》中就已經有了關于桑黃的記載，常用于治療內臟下垂、脫肛瀉血、血崩氣血兩虛等癥狀[2-4]。日本學者IkeKawa等在1968年研究發現，桑黃（Phellinus linteus）子實體提取物具有非常好的抗癌效果，對小鼠肉瘤S180的抑制率可達96.7%，對正常細胞無毒害作用[5-6]。現代醫學研究證實，桑黃提取物對小鼠肝癌H22、肉瘤s180、肺癌Lewis[7]、腦膠質瘤U251[8]、乳腺癌細胞MCF-7[9]、人源性結腸癌細胞HT-29[10]等均有良好的抗瘤作用，同時可以提高人體免疫能力，保護肝臟，治療關節炎等[11-12]。這些都使得桑黃的研究成為人們關注的熱點，使其在藥品研發與臨床應用領域以及保健品開發領域有著廣闊的應用前景。

桑黃廣泛的藥理功能得益于其多種多樣的化學成分，現代生物學研究發現，桑黃的主要化學成分有多糖、黃酮、香豆素、氨基酸、萜類物質和酚類物質等，其中具有較強生物學活性的有效成分主要是多糖、黃酮和三萜等[13-14]，其中又以多糖、黃酮的研究最為系統。多糖存在于子實體、菌絲體和發酵液中，分為子實體多糖、菌絲體胞內多糖（intracellular polysaccharide，簡稱IPS）和胞外多糖（extracellular polysaccharide，簡稱EPS）[15-16]，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖等功效[2]。子實體多糖以雜多糖為主，研究發現的主要單糖有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、樹膠醛糖、果糖、木糖[17-18]。黃酮類化合物是桑黃抗氧化作用的重要物質，總黃酮含量可作為桑黃抗氧化效用的評價標準[19]。現代藥理學研究表明，桑黃黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強免疫的作用[20-21]。

本研究通過液體發酵培養，比較17株桑黃菌株的生物量和黃酮、多糖含量，從中篩選出桑黃黃酮、多糖總產量較高的菌株，以期為生產上桑黃的液體發酵高效生產提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 17株桑黃菌株（JNSH-1～JNSH-17）保存于南京農業大學生命科學學院應用真菌實驗室，各類菌株的來源見表1。

1.1.2 培養基 菌種活化用培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養基[22]，配方如下：200 g馬玲薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，1 000 mL水。配制方法同常規，裝量為8 mL/平皿（直徑為5 cm），倒板后冷卻，備用。

種子液體培養基為PDA液體培養基，配方如下：200 g馬玲薯，20 g葡萄糖，1 000 mL水。配制方法同常規，裝量為 100 mL/瓶（三角瓶容量為250 mL），滅菌后冷卻，備用。

液體發酵培養培養基為CYM（酵母提取物麥芽糖完全培養基），配方如下：10 g麥芽糖，20 g葡萄糖，2 g酵母提取物，2 g 蛋白胨，0.5 g MgSO4·7H2O，4.6 g KH2PO4，1 000 mL去離子水。配制方法同常規，裝量為100 mL/瓶（三角瓶容量為250 mL），滅菌后冷卻，備用。

1.1.3 試劑與溶液 主要試劑有5% NaNO2、濃硫酸、70%乙醇、10%葡萄糖、Al（NO3）3、蕓香苷（純度>95%）、4% NaOH、6%苯酚。

1.1.4 儀器設備 主要儀器設備有28 ℃恒溫培養箱、烘箱、722型可見分光光度計、分析天平、天平、小型種子打碎機、搖床、超聲波清洗儀、超凈臺、臺式高速離心機、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標儀等[22]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種平板的活化 從冰箱保存的斜面試管菌種（母種）中挑取1小塊菌餅塊，接種于PDA固體平板培養基中央，于28 ℃恒溫培養箱中靜置培養。

1.2.2 桑黃一級種的制備 用250 mL三角瓶分裝PDA液體培養基，每瓶裝100 mL，高壓滅菌后使用。用直徑為6 mm的無菌打孔器在活化的平板菌種上選取活力較高的靠近菌絲邊緣的菌絲打孔[19]，挑取8塊帶有培養基的菌絲接種于三角瓶內，于150 r/min、28 ℃恒溫搖床中培養7 d。

1.2.3 二級搖瓶發酵培養 用250 mL三角瓶分裝CYM液體培養基，每瓶裝100 mL，高壓滅菌后使用。將制備好的一級種在無菌條件下用組織勻漿破碎機打碎，按4%的接種量接種到CYM液體培養基中，于150 r/min、28 ℃恒溫搖床中培養7 d。

1.2.4 菌絲生物量的測定 發酵培養7 d后，將菌絲球用20目篩網收集起來，于清水下沖洗，直至培養基完全被洗凈，再將菌絲平攤于已稱質量的無紡布上，在烘箱中于60 ℃烘干，稱量此時的質量，得到菌絲干質量。

1.2.5 黃酮含量的測定 精確稱取0.05 g菌絲粉末，加入 5 mL 70%乙醇，放入超聲清洗機中超聲1 h，獲得萃取液。取1 mL提取液，用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定黃酮含量。用0.1 mg/mL蕓香苷標準品制作標準曲線，計算桑黃中的黃酮含量[22]。

1.2.6 胞內多糖含量的測定 將菌絲烘干研磨成粉末后，精確稱取0.05 g粉末，加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，沸水浴 1 h，吸取提取液備用。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，用1 mg/mL葡萄糖標準溶液繪制標準曲線[23-24]。

1.2.7 數據統計與分析 每組試驗都以3組生物學重復的“平均值±標準差”作為最終結果。對試驗結果進行多重比較分析，不同小寫字母代表在0.05水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 17株桑黃菌株菌絲干質量的比較

用CYM培養基對17株不同的桑黃菌株進行發酵培養，測定菌絲干質量。如圖1所示，不同菌株間的生物量差異較大，在0.054 ～0.645g/100 mL之間;生物量較高的菌株有JNSH-14、JNSH-15、JNSH-1、JNSH-9、JNSH-5、JNSH-2，分別達到6.45、5.87、5.44、4.65、4.34、4.18 g/L。

2.2 17株桑黃菌株菌絲黃酮含量的比較

如圖2所示，17株桑黃菌株的黃酮含量有一定差異，在0.116 ～0.717mg/100 mg之間。黃酮含量較高的菌株有JNSH-15、JNSH-2、JNSH-5，分別達到0.717、0.589、0.532 mg/100 mg。

2.3 17株桑黃菌株菌絲多糖含量的比較

如圖3所示，17株桑黃菌株的多糖含量差異相對較小，在6.778 ～15.876mg/100 mg之間。桑黃多糖含量較高的菌株有JNSH-8、JNSH-12、JNSH-15，分別達到15.876、15.106、14.218 mg/100 mg。

2.4 17株桑黃菌株菌絲總黃酮產量的比較

為了綜合比較各桑黃菌株的產黃酮特性，計算17株桑黃菌株的總黃酮產量。如圖4所示，JNSH-15菌株的總黃酮產量最高，達到42.048 mg/L;JNSH-2、JNSH-5、JNSH-14的總黃酮產量較高，分別達到24.645、23.086、20.634 mg/L;其他桑黃菌株的總黃酮產量較低。

2.5 17株桑黃菌株菌絲總多糖產量的比較

為了綜合比較各桑黃菌株產多糖的特性，計算17株桑黃菌株的總多糖產量。如圖5所示，JNSH-15菌株的桑黃總多糖產量最高，達到834.146 mg/L;JNSH-1、JNSH-2、JNSH-8的總多糖產量較高，分別達到665.822、553.897、528.135 mg/L;其他桑黃菌株的總多糖產量較低。

3 結論

不同桑黃菌株類別對活性物質產量有著非常重要的影響。本研究首先進行初始菌株的篩選，從17株不同的桑黃菌株（JNSH-1～JNSH-17）中篩選出1株活性物質總產量最高的菌株。黃酮、多糖作為桑黃藥用組成中最為重要、研究得最為系統的2種成分，其產量的高低影響著桑黃的價值[24-25]。因此，本研究選擇黃酮、多糖這2種活性物質的產量作為評判桑黃菌株優劣的標準，從而篩選出最優的桑黃菌株。試驗結果表明，篩選出的JNSH-15菌株在菌絲干質量、黃酮及多糖產量方面均處于較高水平，綜合考慮，將其作為液體發酵生產的最優菌株。

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