不同植物提取物組合對湖羊體外發(fā)酵及其生長的影響

黃江麗 張志紅 王東升

摘要：為研究開發(fā)反芻家畜降甲烷、促生長調(diào)節(jié)劑，采用體外產(chǎn)氣法初步研究不同植物提取物、本試驗構(gòu)建的1株工程菌（1株表達α-淀粉酵母酶的酵母菌）及其不同組合對湖羊瘤胃發(fā)酵過程的影響。體外發(fā)酵試驗表明，博落回提取物既有良好的降甲烷效果，又基本不影響微生物蛋白（membrane cofactor protein，簡稱MCP）產(chǎn)生：發(fā)酵12、24 h，對照組的甲烷產(chǎn)量分別為7.62%、11.74%，而博落回處理組分別為4.92%、6.14%;發(fā)酵36 h的微生物蛋白含量對照組為410 mg/L，而博落回處理組為408 mg/L;添加一定水平的工程菌在基本不影響MCP產(chǎn)生的前提下具有一定的降甲烷效果（降低甲烷產(chǎn)量12.9%）;博落回提取物與大蒜油和工程菌組合處理組與對照組相比，能抑制35.4%的甲烷產(chǎn)生，而其微生物蛋白產(chǎn)量還略高于正對照組，博落回提取物與肉桂油和工程菌組合處理組與對照組相比，抑制20.2%的甲烷產(chǎn)生，微生物蛋白產(chǎn)量則基本與對照持平。進一步的動物試驗表明，博落回提取物與大蒜油按一定比例組合加以一定量的活化工程菌，能降低甲烷生成促進湖羊生長。

關(guān)鍵詞：湖羊;植物提取物;降甲烷;微生態(tài)生長促進劑

中圖分類號： S826.5;S816.7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0189-04

反芻動物瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的甲烷是有機物發(fā)酵的必然產(chǎn)物。據(jù)報道，反芻動物產(chǎn)生的甲烷會造成2%～12%能量的損失[1]。同時，牛、羊等反芻家畜是超強溫室氣體——甲烷的主要排放源，全球數(shù)十億頭反芻家畜每年排出的甲烷達數(shù)億噸，導致溫室效應不斷加劇。目前我國牛、羊等反芻家畜的年存欄數(shù)已達3億頭，隨著牛、羊制品需求量的不斷上升，這一數(shù)字還在不斷刷新，而與此同時我國肩負的溫室氣體減排任務卻十分艱巨。如何在滿足日益增加的牛、羊制品需求的同時，逐步減少溫室氣體排放是各國經(jīng)濟、社會發(fā)展過程中遇到的重大挑戰(zhàn)，具有“降甲烷”和“促生長”雙重功效的微生態(tài)制劑為應對這一挑戰(zhàn)提供了切實可行的途徑。目前，抗生素離子載體等已經(jīng)成功地用于降低瘤胃中能量和蛋白質(zhì)的損失。由于抗生素在乳、肉中殘留及其對人類健康影響的風險，公眾越來越重視抗生素等促生長劑在畜禽生產(chǎn)中的使用情況[2]。因此，開發(fā)天然的瘤胃調(diào)控劑對提高反芻動物生產(chǎn)性能和保護環(huán)境均有重大意義。

植物提取物具有天然無耐藥性、毒副作用小等優(yōu)勢，近年來被廣泛應用于反芻動物瘤胃調(diào)控研究中。本試驗采用體外產(chǎn)氣法初步研究不同植物提取物、本試驗構(gòu)建的一株工程菌（1株表達α-淀粉酵母酶的酵母菌）及其不同組合對湖羊瘤胃發(fā)酵過程的影響，再結(jié)合動物試驗，篩選出1組降甲烷效果良好、有一定促生長作用的微生態(tài)生長促進劑，可為各種反芻家畜降甲烷微生態(tài)生長促進劑的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 體外發(fā)酵試驗

1.1.1 試驗材料 用于本研究的肉桂油、大蒜油、薄菏油、丁香油均購自江西省吉安盛大香料油有限公司，肉桂油的主要成分為肉桂醛和苯乙醛，含量分別為85.61%、7.36%;大蒜油的主要成分為丙級二硫化丙烯，含量為59.86%;薄菏油主要成分為L-薄荷醇，含量為51.58%;丁香油的主要成分為丁香酚，含量為85.13%。博落回提取物（博落回總堿含量≥60%、血根堿含量≥40%）由中科院亞熱帶研究所提供，莫能菌素（有效成分含量為40%）購自江西南昌獸醫(yī)防疫站。供試工程菌（1株表達 α- 淀粉酵母酶的酵母菌，菌種保藏號為CCTCCM 2014390）為筆者所在研究室重組構(gòu)建所得。工程菌的活化：用接種環(huán)挑取一定量的工程菌，于100 mL LED培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h左右即達到生長峰值。

1.1.2 體外瘤胃發(fā)酵試驗設(shè)計 2014年4—12月體外試驗分3批在筆者所在單位動物營養(yǎng)分析實驗室進行。（1）降甲烷天然植物提取物的篩選。試驗設(shè)負對照組（CK組，未添加組）和正對照組即莫能菌素組（添加60 mg/L莫能菌素組），5個處理組分別為肉桂油組、博落回提取物組、大蒜油組、薄菏油組、丁香油組。各處理組濃度統(tǒng)一用量為500 mg/L，每個處理設(shè)5個重復，分別在12、24、36 h測定CH4含量，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液pH值，并把發(fā)酵液保存在4 ℃冰箱中，用于微生物蛋白（membrane cofactor protein，簡稱MCP）含量測定。（2）1株表達a-淀粉酵母酶的體外發(fā)酵試驗。試驗設(shè)負對照組（CK組，未添加組）和正對照組（添加 60 mg/L 莫能菌素組），處理組接種活化的工程菌1 mL，設(shè)5個重復。發(fā)酵24 h測定CH4含量，并測定發(fā)酵液pH值，微生物蛋白含量。（3）降甲烷天然植物提取物與工程菌組合的體外發(fā)酵試驗。試驗設(shè)負對照組（未添加組）和正對照組莫能菌素組（添加60 mg/L莫能菌素）。處理組添加不同比例的植物提取物并接種活化工程菌，組合1為博落回提取物+大蒜油，組合2為博落回提取物+肉桂油，組合3為博落回提取物+大蒜油+工程菌，組合4為博落回提取物+肉桂油+工程菌，天然提取物添加量500 mg/L，工程菌添加量1 mL/50 mL，每個處理設(shè)5個重復。分別在12、24、36 h測定CH4產(chǎn)量，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液pH值，并把發(fā)酵液保存在4 ℃冰箱中，用于微生物蛋白含量測定。

1.1.3 體外培養(yǎng) 采用Mauricio等的壓力讀取式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)[3]進行體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)。體外發(fā)酵瘤胃液取自湖羊養(yǎng)殖基地——樂平市三王牧業(yè)有限公司的5只體質(zhì)量為 （35±3） kg 的成年瘺管湖羊。在試驗當天晨飼前抽取湖羊瘤胃液，4層紗布過濾至預熱處理后的收集瓶，在39 ℃水浴中保溫，沖入CO2厭氧備用。在體外培養(yǎng)前，將發(fā)酵底物（稻草粉、玉米粉和黃豆粉按照2 ∶ 1 ∶ 0. 3比例）及相應量的天然植物提取物和莫能菌素預先裝入100 mL產(chǎn)氣瓶中，然后準確抽取40 mL人工唾液。將產(chǎn)氣瓶用CO2飽和后密封，并于 39 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，再吸取10 mL瘤胃液于產(chǎn)氣瓶中，混勻，產(chǎn)氣瓶置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。厭氧人工瘤胃緩沖液的配制按Menke等的方法[4]配制。

1.1.4 測定指標及方法 CH4和CO2含量的測定采用Gasboard 3200L便攜紅外沼氣分析儀（武漢四方光電科技有限公司），發(fā)酵液pH值用梅特勒-托利多酸度計直接測定，菌體蛋白含量的測定采用Makkar等的試驗原理和試驗方法[5-6]，用嘌呤法測定體外菌體蛋白含量。

1.1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003整理，運用SPSS 18統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較。

1.2 動物試驗

1.2.1 試驗材料 試驗羊由樂平市三王牧業(yè)有限公司提供，請專業(yè)人員裝好瘺管，恢復良好后再供試驗用。試驗于2015年3—9月在樂平市三王牧業(yè)有限公司湖羊養(yǎng)殖基地進行。

1.2.2 試驗方法 試驗選擇15只體質(zhì)量為33～39 kg的成年湖羊作為研究對象，試驗設(shè)1組負對照組（CK組，未添加組）和1組正對照組莫能菌素組（添加60 mg/L）和3個處理組：組合1，博落回提取物+低濃度大蒜油+工程菌;組合2，博落回提取物+高濃度大蒜油+工程菌;組合3，博落回提取物+肉桂油+工程菌。各組之間博落回提取物和工程菌的添加量一致，分別為每只羊添加21 mg/d博落回提取物和活化的工程菌1 mL;組合1的大蒜油添加油為每只羊添加70 μL/d;組合2的大蒜油添加量為每只羊添加700 μL/d;組合3的肉桂油添加量為每只羊添加175 μL/d。每組設(shè)3只湖羊重復，預飼期10 d，正式試驗15 d，處理組將添加物每天直接添加到精料中喂食。精料和粗料分開飼喂，每只羊飼喂 400 g/d 精料（分2次）、950 g/d粗料，精粗比為3 ∶ 7，09：00—10：00第1次飼喂，15：00—16：00第2次飼喂，定時定量飼喂湖羊。粗料由苔草和花生秧組成，精料由玉米粉、黃豆粉和麩皮組成。每天記錄飼料剩余情況，正式試驗3 d后采集1次瘤胃液，分析瘤胃液各項指標性能并發(fā)酵24 h后測定甲烷產(chǎn)量、瘤胃液pH值、微生物蛋白等指標。試驗結(jié)束后再取瘤胃液進行分析，并對羊的體質(zhì)量進行稱量。

1.2.3 測定指標與方法 CH4和CO2含量的測定采用Gasboard 3200L便攜紅外沼氣分析儀（武漢四方光電科技有限公司），發(fā)酵液pH值用梅特勒-托利多酸度計直接測定，菌體蛋白含量的測定采用Makkar等的嘌呤法[5-6]測定體外菌體蛋白含量。

1.2.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003整理，運用SPSS 18統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外發(fā)酵試驗

2.1.1 植物提取物對甲烷產(chǎn)生、發(fā)酵液MCP和pH值的影響 先通過查閱文獻初步確定初篩對象，再經(jīng)過大量反復的體外發(fā)酵試驗，篩選出部分降甲烷效果較好的植物提取物（表1）。由表1可見，與負對照組相比，肉桂油、博落回提取物、大蒜油、薄荷油、丁香油在發(fā)酵12 h時，均有不同程度抑制甲烷產(chǎn)生的效果，其中肉桂油的抑制效果最明顯，大蒜油次之，博落回提取物、薄荷油、丁香油這3種抑制效果接近。發(fā)酵到24 h時，肉桂油抑制甲烷產(chǎn)生效果依然最顯著，大蒜油次之，而丁香油已無抑制效果。發(fā)酵到36 h時，肉桂油的抑制效果比較明顯，甚至超出正對照組莫能菌素組，其他的均基本已經(jīng)恢復與對照相同的產(chǎn)甲烷水平。

發(fā)酵12 h時，肉桂油抑制產(chǎn)甲烷效果明顯高于莫能菌素組，大蒜油的抑制效果與莫能菌素組相當，其他組的抑制效果不同程度地低于莫能菌素組;發(fā)酵24 h時，肉桂油的抑制效果極顯著高于莫能菌素組，然后依次是大蒜油、薄荷油、博落回提取物，而丁香油組則顯著高于莫能菌素組，與負對照組相當，即丁香油在24 h已無抑制效果;發(fā)酵到36 h時，則除了肉桂油抑制效果高于莫能菌素外，其他的抑制效果都不同程度地低于莫能菌素組，均與負對照組相當，即除肉桂油組外，其他試驗組已無抑制效果。

MCP是反芻動物最主要的氮源供應者，pH值是一項反映瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的指標。本試驗取發(fā)酵36 h后的發(fā)酵液并測定其pH值和MCP含量。由表2可知，除博落回提取物處理的發(fā)酵液MCP含量與正負對照組接近外，其他處理均不同程度低于正負對照組，以大蒜油含量最低;各處理pH值與正負對照差異均不顯著，說明不同處理對瘤胃環(huán)境影響不大。

2.1.2 1株表達α-淀粉酵母酶的酵母菌的體外發(fā)酵試驗 初步了解到，瘤胃液體外發(fā)酵24 h即能大致確定各項指標的變化。因此，為節(jié)省工作量，低甲烷活性菌群的選育只選取發(fā)酵24 h這一時間點測定各項指標。由表3可知，發(fā)酵24 h時，與負對照組相比，工程菌處理組（降低12.9%）有部分降甲烷效果，但沒有正對照組效果明顯。而微生物蛋白含量與負對照組略有下降但明顯高于正對照組，而各處理的pH值變化不大。說明工程菌處理組在影響微生物蛋白產(chǎn)量和瘤胃環(huán)境較小的前提下，能同時抑制甲烷的產(chǎn)生，是一種潛在的理想添加劑。

2.1.3 降甲烷天然植物提取物與工程菌組合的體外發(fā)酵試驗 通過不同組合和添加不同的天然植物提取物并接種活化的工程菌反復進行瘤胃液的體外發(fā)酵試驗，篩選出各項指標相對理想的組合。由表4可知，與負對照組相比，不同組合處理均有抑制甲烷的效果，其中組合3效果最為明顯，約降低32.5%，而其微生物蛋白還顯著高于正對照組;其次是組合1和組合4，分別約降低30.1%、20.5%，而組合1的微生物蛋白含量則略低于組合4。莫能菌素作為正對照，抑制甲烷效果均比各處理顯著，但由于其強抑制甲烷產(chǎn)生，而導致微生物蛋白含量也是最低。另外，從表4還可以看出，各處理的pH值比較接近，無明顯變化。綜合考慮各項指標變化可以得知，組合3和組合4是比較理想的處理組合。

2.2 動物試驗

2.2.1 試驗對瘺管湖羊采食量的影響 圖1為動物試驗用瘺管湖羊。由于添加的博落回提取物和精油有刺激味特別是大蒜油比較明顯，所以在飼喂瘺管羊的過程中發(fā)現(xiàn)直接飼喂會比較嚴重影響羊的采食量（表5），而莫能菌素可能是由于采用無水乙醇處理而嚴重影響試驗羊的食欲。

2.2.2 試驗對瘺管湖羊瘤胃液的影響 動物試驗3 d后各處理對瘺管羊瘤胃液的影響總結(jié)見表6，由于試驗儀器故障，甲烷的產(chǎn)生量沒收集到數(shù)據(jù)。由表6可知，與負對照組相比，除組合2的微生物蛋白含量提高較少外（提高6.5%），組合1和組合3均顯著提高了微生物蛋白量（提高84.5%和67.6%），也同時均高于正對照莫能菌素的微生物蛋白量（提高36.8%和24.3%）;組合2略高于負對照組，而低于正對照組。與負對照相比，組合1氨態(tài)氮含量顯著提高（81.6%），組合2和組合3的氨態(tài)氮含量分別提高40.8%、44.7%;3個組合氨態(tài)氮含量均高于正對照組（分別為30.2%、0.9%、3.8%）。與負對照組相比，組合1和組合2的pH值明顯降低，而組合3的pH值變化不大，而正對照組的pH值則顯著高于各處理組。

由表7可知，與負對照相比，組合1和組合2降甲烷效果明顯，甲烷產(chǎn)生量分別降低18.5%和23.7%，不過均低于莫能菌素的抑制效果（甲烷產(chǎn)生量降低48.4%），有可能是與莫能菌素添加量過大有關(guān)系;組合3無抑制產(chǎn)甲烷效果，反而促進了甲烷生成。與負對照組相比，除組合2的微生物蛋白含量略有降低外（降低1.8%），與3 d動物試驗后的瘤胃液變化相同，組合1和組合3均顯著提高了微生物蛋白量（35.4%、37.2%），但略低于正對照組莫能菌素的微生物蛋白含量;與負對照組相比，與3 d動物試驗后的瘤胃液變化相反，組合1氨態(tài)氮含量顯著降低44.4%，組合2和組合3的氨態(tài)氮含量變化不大（組合2降低7.3%和組合3提高6.0%）。各處理組的瘤胃液pH值變化均不大，表明整個瘤胃液系統(tǒng)狀態(tài)基本穩(wěn)定。綜合考慮表6、表7動物試驗羊瘤胃液各個指標變化結(jié)果可知，組合1是比較理想的降甲烷微生態(tài)調(diào)控劑配方，而組合3在動物試驗3、7 d對瘤胃液的降甲烷效果存在截然相反的效果，具體原因有待進一步研究分析。

2.2.3 試驗對瘺管湖羊體質(zhì)量的影響 由表8可知，組合1處理的湖羊體質(zhì)量增加率比負對照組略高0.93%，而比正對照高50.14%，說明組合1作為添加劑明顯優(yōu)于莫能菌素。組合2的湖羊平均體質(zhì)量增長率比負對照組高4.81%，比組合1高約3.9%，這可能與添加的大蒜油濃度略高，能更好地抑制甲烷的同時又對微生物活動影響不大有關(guān)系。而組合3的湖羊平均體質(zhì)量增長率遠低于對照組，其原因有待進一步的試驗求證。在本研究中，綜合各項指標及動物試驗，組合1和組合2是相對理想的處理組合，而它們的差別也僅是添加的大蒜油濃度不一樣，所以進一步摸索不同的大蒜油添加比例，以達到最佳的降甲烷和促生長效果。

3 討論

3.1 體外發(fā)酵試驗

本研究應用體外發(fā)酵試驗主要測定湖羊發(fā)酵液的甲烷產(chǎn)量、MCP含量及其pH值，初步篩選湖羊降甲烷，促生長微生態(tài)制劑成分及組合。有研究表明，博落回是一種純天然綠色生物“三藥”產(chǎn)品，可以作為防治水果、蔬菜、糧食作物、棉花的病蟲害[7-8]等的生物農(nóng)藥、獸藥、醫(yī)藥原料。此外，博落回被歐洲食品安全局認可為用于動物飼料添加劑的資源植物[9-10]。在奶牛飼糧中添加博落回提取物可以增加氮的利用效率，因為博落回提取物加強了瘤胃微生物作用，減少了瘤胃無氨態(tài)氮降解作用，從而加強了瘤胃氮的消化[11];此外，博落回提取物對奶牛的乳房炎具有改善作用。在羊飼糧中添加博落回提取物可以幫助改善由于酷暑造成生長性能下降的不良反應，這種改善作用可能是由于抗炎作用和營養(yǎng)吸收加強而形成的[12]。博落回提取物在湖羊瘤胃體外試驗中，低濃度時提高甲烷產(chǎn)生，高濃度時能有效降低甲烷，促進發(fā)酵模式由乙酸型向丙酸型轉(zhuǎn)變[13]，所以本研究所采用的博落回提取物添加濃度相對較高，而且沒設(shè)濃度梯度，其添加濃度的影響有待進一步的研究探索。植物精油在反芻動物瘤胃發(fā)酵調(diào)控中的研究比較多[14-15]。本研究以降甲烷、促生長為主要目標，發(fā)現(xiàn)肉桂油、大蒜油和博落回提取物的降甲烷效果良好，而其中只有博落回提取物處理組的MCP含量與對照接近，其他都不同程度地導致了MCP含量的降低。

飼糧中添加釀酒酵母培養(yǎng)物對穩(wěn)定幼年或成年反芻動物瘤胃內(nèi)微生物活動、保持正常的pH值、降低乳酸生成量、防止酸中毒、促進纖維分解菌生長方面都有積極作用[16]，本研究采用直接添加活化的筆者所在實驗室重組的1株酵母工程菌，簡單易行，結(jié)果表明其有一定的抑制甲烷效果，而對瘤胃液的MCP含量及pH值基本無影響。結(jié)合前面試驗的結(jié)果，本研究進行幾種天然植物提取物與工程菌組合的湖羊的體外發(fā)酵，篩選出博落回提取物與肉桂油或者大蒜油輔以一定劑量的重組工程菌組合來進行下一步的動物試驗，而對各成分的添加比例及相互作用機制則未涉及，有待進一步的研究。

3.2 動物試驗

由于添加的博落回提取物和精油有刺激味，特別是大蒜油比較明顯，所以會比較嚴重影響羊的采食量，而添加低濃度大蒜油的平均剩料量反而比添加高濃度的大蒜油的略高，其原因有可能與羊的個體差異、試驗過程數(shù)據(jù)收集誤差有關(guān)，而莫能菌素組可能是采用無水乙醇處理嚴重影響試驗羊的食欲。試驗對瘺管湖羊瘤胃液的影響依然是采用體外培養(yǎng)的方法，添加了肉桂油組的組合在動物試驗后7 d的甲烷產(chǎn)量相比對照還高，在一定程度上說明肉桂油后續(xù)有促進甲烷生成的作用，但由于體外試驗的局限性，這一結(jié)果還有待于更先進、更科學的方法如呼吸室法等來檢驗。而各處理組對瘤胃液的影響則可以通過研究其瘤胃液微生物的結(jié)構(gòu)變化進行進一步的分析。添加大蒜油的組合處理組與對照組相比均提高了湖羊的體質(zhì)量增長率，其添加比例有待進一步優(yōu)化;而添加了肉桂油的組合處理組和添加莫能菌素組的湖羊組體質(zhì)量增長率反而降低，其原因有待進一步研究。

4 結(jié)論

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，降甲烷的天然植物提取物比較多，但要達到降甲烷的同時，既能提高飼料利用率和生長速率相對較少，筆者通過大量的篩選和反復試驗發(fā)現(xiàn)，博落回提取物基本具備這三重功效，是一種潛在的理想的反芻動物飼料天然植物添加劑。筆者所在的實驗室構(gòu)建的酵母工程菌也有一定的降甲烷能力，而其對反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響則有待更深入研究。博落回提取物與大蒜油按一定比例組合并加以一定量的活化工程菌，無論在體外發(fā)酵試驗還是在瘺管湖羊的動物試驗，均降低甲烷生成。但由于博落回提取物與大蒜油的刺激性氣味，其適口性還有待大大改善，還應進一步摸索不同的大蒜油添加比例，以達到最佳的降甲烷和促生長效果。

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