劉林峰 林玲 周陽(yáng)

摘要：以紅芽佛手、自選9803、安73等3個(gè)紫芽茶樹(shù)品種（系）的1芽3葉茶梢為研究對(duì)象，采用紫外-可見(jiàn)光譜和高效液相色譜技術(shù)，分析研究不同品種（系）、不同部位、不同生長(zhǎng)季節(jié)茶樹(shù)紫色芽葉花色苷的富集特性，以期為茶樹(shù)紫色芽葉及其花色苷的高值化利用提供參考。結(jié)果表明，不同品種（系）、不同部位、不同生長(zhǎng)季節(jié)茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集能力存在顯著差異;不同茶樹(shù)品種（系）富集能力由強(qiáng)到弱依次為自選9803>安73>紅芽佛手，不同部位富集能力由強(qiáng)到弱依次為第1>第2>芽頭>第3，同時(shí)3個(gè)茶樹(shù)品種（系）隨春末、夏初、夏中、夏末、秋初、秋中的季節(jié)變化對(duì)花色苷的富集呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，自選9803葉片在夏末花色苷含量達(dá)到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末達(dá)到最大值（12.63 mg/g），紅芽佛手則在夏初達(dá)到最高值（7.33 mg/g）。

關(guān)鍵詞：茶葉;紫芽;花色苷;富集特性

中圖分類號(hào)：S571.101 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0169-03

茶樹(shù)紫色芽葉是由茶葉花色苷引起的，花色苷屬多酚類物質(zhì)，多以糖苷形式存在[1]，易溶于水和乙醇、甲醇等醇類化合物，不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定，其顏色隨pH值的變化而變化[2]。研究證實(shí)，花色苷具有抗氧化、清除自由基、護(hù)肝解毒等[3-7]多種生物活性，被廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工、紡織等[8]領(lǐng)域，是近年茶樹(shù)種質(zhì)資源及功能成分利用的研究熱點(diǎn)。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所選育了高花色苷茶樹(shù)品種紫娟;劉富知等發(fā)現(xiàn)，4.35%的安化群體茶樹(shù)品種具有高花色苷特征[9];蕭力爭(zhēng)等比較了5個(gè)特定紫芽茶樹(shù)品種春梢芽葉中花色苷含量的差異[10];李燕麗等檢測(cè)了不同季節(jié)紫娟茶花色苷相對(duì)含量[11];Lai等分析了紫芽茶樹(shù)品種紫娟花色苷的累積情況[12]。然而，鮮見(jiàn)對(duì)花色苷及組分在不同品種（系）、不同部位、不同生長(zhǎng)季節(jié)茶樹(shù)中富集特性的系統(tǒng)研究。本研究以紅芽佛手、自選9803、安73等3個(gè)紫芽茶樹(shù)品種（系）的1芽3葉茶梢為對(duì)象，采用紫外-可見(jiàn)光譜和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，分析不同品種（系）、不同部位、不同生長(zhǎng)季節(jié)茶樹(shù)紫色芽葉花色苷及其組分的富集特性，以期為茶樹(shù)紫色芽葉及其花色苷的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從2016年4月中下旬開(kāi)始至2016年9月中旬每15 d采摘1次湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)安教學(xué)實(shí)踐基地茶園中易紫芽化自選9803、紅芽佛手和安73等3個(gè)茶樹(shù)品種（系）的1芽3葉，并將其芽頭、第1葉、第2葉和第3葉分開(kāi)收集，冷凍干燥后制成干粉，塑料袋密封后保存于冰箱中，備用。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

試劑：乙腈、甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）、無(wú)水乙醇（分析純）均購(gòu)于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷購(gòu)于北京譜析科技有限公司;飛燕草素-葡萄糖苷購(gòu)于西寶生物科技（上海）股份有限公司;超純水自制;酸性乙醇水溶液（85 mL 無(wú)水乙醇加15 mL 1%鹽酸水）自配。

儀品設(shè)備：C18 ECOSIL HPLC COLUMN色譜分析柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm，日本ECOSIL公司）、UV754N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（德國(guó)Thermo Scientific公司），高效液相色譜儀A20（日本島津公司），精密電子天平（瑞士Starorius公司），pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司），超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司），DSY-2-8水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 花色苷提取 參照文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用回流提取方法提取茶葉干粉中的花色苷，提取條件為80%乙醇（添加1%冰乙酸水溶液）、1 g ∶ 50 mL料液比，80 ℃下回流提取 60 min，過(guò)濾取濾液[13-15]。

1.3.2 紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)花色苷總量 參照?qǐng)?bào)道文獻(xiàn)，采用單一pH法，吸取4 mL樣品提取濾液用酸性乙醇水溶液定容至10 mL以酸性乙醇水溶液為空白對(duì)照，顯色30 min，在 535 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次[16-17]，根據(jù)以下公式[18]計(jì)算花色苷總量：

花色苷總量=[（D試液-D對(duì)照液）×101.83]/[吸取溶液量/樣品干質(zhì)量][19]。

式中：101.83為摩爾消光系數(shù)。

1.3.3 HPLC外標(biāo)法檢測(cè)茶葉花色苷組分 色譜柱為C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 520 nm，流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～60 min，10%～40% B），流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，系統(tǒng)平衡 10 min 后再次進(jìn)樣。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 22.0進(jìn)行方差分析，各處理組間采用最小顯著差數(shù)法（LSD法）比較，P<0.05時(shí)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹(shù)品種（系）花色苷富集差異比較

圖1顯示，不同茶樹(shù)品種（系）所富集的花色苷總量存在顯著差異（P安73（8.11 mg/g）>紅芽佛手（4.98 mg/g）;同時(shí)，3個(gè)品種（系）樣品和3種標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)樣的HPLC圖譜相比，茶樹(shù)紫色芽葉中的花色苷組分與其他常見(jiàn)植物中的花色苷組分并不相同，組分1～7為3個(gè)品種（系）所共有（圖2），表示這7個(gè)組分可作為茶樹(shù)紫色芽葉中的特征花色苷組分，且以組分5和組分6含量較高，但其分子結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步探究;也進(jìn)一步說(shuō)明在外界環(huán)境差異不大的情況下，茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集主要取決于品種（系）的遺傳因素。

表1表明，同一生長(zhǎng)季節(jié)，不同茶樹(shù)品種（系）的花色苷總量存在顯著差異。自選9803花色苷富集能力最強(qiáng)，在各生長(zhǎng)季節(jié)與紅芽佛手均存在顯著性差異（P<0.05）;安73富集能力次之，在春秋（除秋初外）2季富集明顯不如9803（P<0.05），在夏中和夏末則明顯強(qiáng)于紅芽佛手（P<0.05），說(shuō)明茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集也受生長(zhǎng)季節(jié)等環(huán)境因素的影響。

圖3表明，芽頭部分自選9803的花色苷總量顯著高于安73和紅芽佛手（P<0.05），第1葉部分第3個(gè)品種（系）之間差異顯著（P<0.05），第2葉部分紅芽佛手富集能力顯著低于其他2個(gè)品種（P<0.05），第3葉部分3個(gè)品種（系）含量差異不顯著;由此提示，不同茶樹(shù)品種（系）對(duì)花色苷的富集還與芽葉分化成熟度有關(guān)。

2.2 不同部位花色苷富集差異比較

圖4顯示，茶樹(shù)紫色芽葉花色苷在第1中富集最多，在第3葉中富集最少，并與其他部位有顯著性差異（P第2葉（7.44 mg/g）>芽頭（6.91 mg/g）>第3葉（4.46 mg/g），猜測(cè)茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集可能與葉片基因的表達(dá)受葉片成熟度的影響有關(guān)。

由表2可知，同一生長(zhǎng)季節(jié)不同茶樹(shù)芽葉部位對(duì)花色苷的富集能力存在顯著差異，其中第1葉富集能力最強(qiáng)，在各生長(zhǎng)季節(jié)與其他部位均存在顯著差異（P<0.05）;各部位的花色苷總量均隨生長(zhǎng)季節(jié)的變化而表現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，其中，第1、2中的花色苷總量隨季節(jié)變化相對(duì)明顯，而芽頭和第3葉花色苷總量隨季節(jié)變化不明顯，表明茶樹(shù)不同芽葉部位隨生長(zhǎng)季節(jié)變化而對(duì)花色苷的富集差異主要體現(xiàn)在第1、2葉的差異上。

2.3 不同生長(zhǎng)季節(jié)花色苷富集差異比較

圖5表明，茶樹(shù)在不同生長(zhǎng)季節(jié)對(duì)花色苷富集特性呈現(xiàn)出由春季到夏季緩慢升高，夏末后逐漸降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明光照、溫度等環(huán)境因素的變化對(duì)茶樹(shù)富集花色苷影響較大，這可能是由于光照度、光質(zhì)、氣溫、濕度等影響了茶樹(shù)花色苷代謝途徑中相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而使得茶樹(shù)在夏季對(duì)花色苷的富集作用增強(qiáng)。

3 討論

茶葉花色苷是花青素與糖苷的結(jié)合物，其中花青素是由查爾酮合成的，具有多種生物活性，研究茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集特性對(duì)選育高花色苷茶樹(shù)品種、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培茶樹(shù)以及開(kāi)發(fā)利用茶葉花色苷具有重要的理論與實(shí)踐意義[19]。資料表明，植物葉片在不同的發(fā)育期對(duì)逆境脅迫敏感度不同，且不同葉片花色苷關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)量和累積量不同[20-21];在茶樹(shù)花青素合成途徑中部分關(guān)鍵酶基因在嫩葉中的表達(dá)水平明顯高于老葉[22]。本研究發(fā)現(xiàn)不同品種（系）、不同部位、不同生長(zhǎng)季節(jié)茶樹(shù)中的花色苷總量存在顯著差異，與前人研究結(jié)果[21-24]相符。3個(gè)茶樹(shù)品種（系）對(duì)花色苷的富集能力由強(qiáng)到弱依次為自選9803>安73>紅芽佛手，不同部位富集能力由強(qiáng)到弱依次為第1葉>第2葉>芽頭>第3葉，同時(shí)隨著由春末至秋中的季節(jié)變化，茶樹(shù)對(duì)花色苷的富集總體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中，自選9803葉片在夏末花青素含量達(dá)到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末達(dá)到最大值（12.63 mg/g），紅芽佛手則在夏初達(dá)到最高值（7.33 mg/g），與前人對(duì)光照等環(huán)境因子調(diào)控茶樹(shù)紫色芽葉的研究結(jié)果[23-24]相一致，說(shuō)明茶樹(shù)紫色芽葉對(duì)花色苷的富集同時(shí)受到茶樹(shù)種質(zhì)、生長(zhǎng)環(huán)境、分化發(fā)育程度等多種因素的調(diào)控。芽頭的嫩度最好，但花色苷富集能力卻較第1葉弱的原因，有必要后期從茶樹(shù)芽葉不同部位中花色苷代謝途徑關(guān)鍵酶基因?qū)用骈_(kāi)展深入研究。另一方面，本研究通過(guò)HPLC檢測(cè)到的7個(gè)茶樹(shù)紫芽花色苷組分尚未作分離鑒定，后續(xù)研究可通過(guò)應(yīng)用最新分離純化技術(shù)獲得花色苷組分單體，以便進(jìn)一步探究茶樹(shù)紫色芽葉花色苷的化學(xué)密碼。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪恒武. 茶樹(shù)紅紫芽葉形成及其控制的探討[J]. 茶葉通訊，1979（3）：6-15.

[2]汪慧華，趙晨霞. 花青素結(jié)構(gòu)性質(zhì)及穩(wěn)定性影響因素研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)（農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)），2009（9）：32-35.

[3]Pantelidis G E，Vasilakakis M，Manganaris G . Antioxidant capacity，phenol，anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries，blackberries，red currants，gooseberries and cornelian cherries[J]. Food Chemistry，2007，102（3）：777-783.

[4]Azuma K，Ohyama A，Ippoushi K，et al. Structures and antioxidant activity of anthocyanins in many accessions of eggplant and its related species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（21）：10154-10159.

[5]劉宵宵，簡(jiǎn)美玲，毛潤(rùn)乾. 花色苷類物質(zhì)降血脂機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（3）：139-144.

[6]Yang Y，Andrews M C，Hu Y，et al. Anthocyanin extract from black rice significantly ameliorates platelet hyperactivity and hypertriglyceridemia in dyslipidemic rats induced by high fat diets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（12）：6759-6764.

[7]Xue Y L，Miyakawa T，Hayashi Y，et al. Isolation and tyrosinase inhibitory effects of polyphenols from the leaves of persimmon，diospyros kaki[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（11）：6011-6017.

[8]Rashid K，Wachira F N，Nyariki J N，et al. Kenyan purple tea anthocyanins and coenzyme-Q10 ameliorate post treatment reactive encephalopathy associated with cerebral human African trypanosomiasis in murine model[J]. Parasitology International，2014，63（2）：417-426.

[9]劉富知，黃建安，付冬和，等. 茶樹(shù)上紅紫色芽葉部分生化特性的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26（1）：41-42，57.

[10]蕭力爭(zhēng)，蘇曉倩，李 勤，等. 紫芽品種茶樹(shù)芽葉多酚類物質(zhì)組成特征[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，34（1）：77-79.

[11]李燕麗，羅瓊仙，關(guān)文玉，等. 紫娟茶花色苷的類型、組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的季節(jié)性變化[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，38（6）：1-6.

[12]Lai Y S，Li S，Tang Q，et al. The dark-purple tea cultivar ‘Ziyan accumulates a large amount of delphinidin-related anthocyanins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（13）：2719-2726.

[13]王秋霜，凌彩金，劉淑媚，等. 紅紫芽茶葉花青素提取分離及pH穩(wěn)定性初探[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（9）：291-296.

[14]李 璐，倪婷婷，關(guān)文玉，等. 基于響應(yīng)面法提取‘紫娟茶花青素最佳工藝的優(yōu)化研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（4）：1704-1709.

[15]羅正飛，梁名志，王立波. “紫娟”茶花青素提取工藝研究[J]. 滇西科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（4）：111-114.

[16]孫建霞，張 燕，孫志健，等. 花色苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2009，30（5）：263-268.

[17]陳 瓊，陸瑞瓊. 茶樹(shù)芽葉花色苷含量測(cè)定方法的研究[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，29（2）：41-44.

[18]黃意歡. 茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997：125-126.

[19]Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. The Plant Cell，1995，7（7）：1071-1083.

[20]Wei K，Zhang Y Z，Wu L Y，et al. Gene expression analysis of bud and leaf color in tea[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2016，107：310-318.

[21]張佩佩，張 亮，鄭鳳霞，等. 植物葉片中花青素的積累規(guī)律及生物學(xué)作用[J]. 北方園藝，2014（20）：188-192.

[22]周瓊瓊，孫威江. 茶樹(shù)芽葉紫化的生理生化分析及其關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（1）：86-91.

[23]金琦芳，孫威江，陳志丹. 光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成的調(diào)控機(jī)理[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（6）：20-27.

[24]李 智. 不同環(huán)境因子調(diào)控茶樹(shù)紫色芽葉形成的分子機(jī)制研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：54-58.