庫爾勒香梨黑頭病病原菌的分離鑒定

歐陽輝 張偉達 程少波

摘要：為了分離、鑒定庫爾勒香梨黑頭病病原菌，并結合形態學和分子生物學等手段對致病菌進行鑒定，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板法對致病菌株進行分離純化，觀察病原菌株的菌落特征，通過顯微鏡觀察病原孢子形態特征，并根據回接試驗確定其致病性能。結果表明，從病梨萼端表面及香梨生長環境中共分離出11株菌株，綜合病原菌菌落形態、孢子顯微結構及回接試驗，篩選出2株候選菌株（SY-6、XL-6），其回接香梨的病癥與正常發病的香梨較相似。通過十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法提取病原菌DNA，經rDNA內轉錄間隔區（ITS-rDNA）基因片段測序及美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網站的同源性比對，鑒定得出SY-6、XL-6均屬于鏈格孢屬。結果共分離出2株鏈格孢屬病原菌，致病癥狀與自然發病的香梨較相似，結果與筆者所在課題組的前期研究結果相吻合，從而為研究病原菌致病機制提供了參考。

關鍵詞：庫爾勒香梨;黑頭病;致病菌;鑒定

中圖分類號： S436.612.1+9 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0116-04

庫爾勒香梨是新疆地區最主要的特色果品之一，由于其皮薄汁豐、品質優良而享譽全國。新疆得天獨厚的地理優勢和氣候條件造就了庫爾勒香梨獨特的口感和品質，庫爾勒香梨果實大小適中，形如紡錘，果皮黃綠，果味濃芬，果肉酥脆爽口，清甜多汁，其含糖量約為10%，含水量約為86%，同時富含多種維生素[1]。庫爾勒香梨不但具有很高的食用價值，還有潤肺、涼心、消疾、驅毒、切片貼燙火傷止痛不爛等藥用功效，深受廣大消費者青睞。

近年來，新疆香梨的種植面積及貯藏容量在逐年增加。據統計，截至2016年，新疆香梨種植面積達7萬hm2，產量為114萬t[2]，2016年僅出口產值便達407.62萬美元。由于經濟價值高、種植面積不斷擴增、產量高，香梨的貯藏保鮮成為一個關鍵問題，經過多年技術攻關，貯藏冷庫成為目前果農的一項選擇，但是香梨在貯藏過程中容易受到病害影響，例如凍害、病蟲害、褐斑病、輪紋病、炭疽病、青霉病、褐腐病及黑頭病等[3]，這些病害嚴重降低了商品價值，尤其是庫爾勒香梨黑頭病，其發病率高達10%，已經成為制約香梨鮮果品質提升的主要問題。2011年，唐文娟等通過對黑頭病病原菌致病性的研究發現，其主要侵染特征[4]表現為果實萼端深綠色，且硬度較高;發病初期萼端果皮變黑色，表皮切開后可發現果肉有淺褐色蜂窩狀壞死現象，且表觀呈現未病變狀態的果肉組織略有苦味;發病后期黑頭部位稍有塌陷，萼端產生黑色霉層，病斑邊緣處果皮變為黑色，病斑與內部好果肉的交界非常明顯，呈蜂窩狀的黑頭病部位在伴隨黏稠黑汁狀物質產生的同時，存在侵染性腐爛由果皮向果肉逐漸擴散的現象。由于該疾病在香梨貯藏期間高發，同時又嚴重影響香梨的貯藏品質，所以為了降低香梨發病造成的經濟損失，同時避免這種病害長期存在，對黑頭病致病菌的研究是非常必要的。

本研究采用分子生物學和形態學相結合的方法對病原菌進行鑒定，以期為香梨黑頭病抗病機制的研究及防治提供理論依據，從而降低黑頭病發病率，延長香梨貯藏時間，提高香梨品質并促進其產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用庫爾勒香梨（健康果及病果）均于2016年采自庫爾勒市冷藏庫及氣調庫;庫爾勒香梨樹葉及土壤樣本采自新疆生產建設兵團第二師28團香梨果園。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基[5]，購自青島海博生物技術有限公司;十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）提取液（200 mL）[6]，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA純化試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司;十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS），購自北京博奧拓達科技有限公司;酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，購自北京索萊寶科技有限公司;Gold View，購自北京博奧拓達科技有限公司。

LabCycler-PCR擴增儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Thermo Fisher Scientific）;QUANTUM ST4全自動凝膠成像儀，北京五洲東方科技發展有限公司;1645056高壓電泳儀，北京六一生物科技有限公司;FRESCO 21離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 菌株的分離純化及保存

1.2.1 環境中病原菌的篩選 準確稱取10.0 g土壤樣品，于PDA液體培養基中富集，在搖床上于28 ℃、120 r/min培養48 h，吸取200 μL培養液至PDA固體培養基上，涂布均勻，于28 ℃倒置培養。從梨樹枝條上摘取大小形態完整、無明顯病態的葉片，用75%乙醇棉球擦拭表面，再用無菌水沖洗3次后自然晾干。用滅菌的打孔器取直徑為0.5 cm的葉片切片，放置于PDA固體培養基中，于28 ℃倒置培養。待長出菌落后，將所有菌落采用劃線法或點植法轉接純化，直至出現單一穩定的菌落。菌落每次轉接均設3組重復。將最終分離的菌落回接未染病香梨進行致病性能的確定。

1.2.2 發病香梨表面病原菌的分離篩選 依據柯赫氏法則[7]從庫爾勒香梨的病健相接處切下3處病變組織，在PDA固體培養基上，于28 ℃培養。待長出菌落后，將所有菌落采用劃線法或點植法轉接純化5次，直至分離出菌落大小、形狀、顏色、表面光滑濕潤程度、菌絲生長速度、菌絲形狀、產孢情況、孢子顏色、形狀等一致的若干菌株[8]。病變香梨樣品有15個，每個香梨設3組平行，菌落每次轉接均設3組重復。最終將初分離得到的菌落回接到未致病香梨果實上得到致病香梨，進而與未致病香梨比較，進行致病性能的確定。

1.2.3 病原菌的保存 用液體培養法將分離純化后的致病菌培養至對數期，保存于50%滅菌甘油（用蒸餾水配制）中，于-80 ℃保存。與此同時，將病原菌接種在斜面固體PDA培養基中，培養3 d后，于4 ℃保存備用。

1.3 菌株的形態學鑒定

將已分離純化的菌種接種在PDA固體培養基平板上，于28 ℃培養，自第4天開始觀察菌落的生長狀況。病原菌菌落形態：觀察分離培養基上病原菌的菌落形態（包括形狀、大小、菌落色澤、菌落表面結構、菌落滲出物及菌落邊緣特征）。菌落形態特征的描述參照《真菌鑒定手冊》[9]《中國真菌志》[10]《植物病原真菌學》[11]及《真菌的形態和分類》[12]。

1.4 回接試驗

從氣調貯藏庫選取健康的庫爾勒香梨果實，于室溫放置6 h后，在無菌條件下，用75%乙醇棉球表面擦拭消毒，后用無菌水沖洗5次，自然晾干，進行接種。用無菌打孔器在庫爾勒香梨萼部分別打3個直徑為0.5 cm、深度為0.2 cm的孔用于接種，取相同直徑的病原菌餅接種于打孔處，將單果實獨立分裝于無菌密封袋中，室溫存放。用分離出的每個病原菌分別接種香梨果實，每個菌種為1個處理，每個處理重復3次。在25 ℃、相對濕度（RH）保持在90%以上培養5～15 d后對其進行觀察，若癥狀與致病香梨癥狀一樣，則初步確定該菌株為病原菌。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

1.5.1 病原菌的DNA提取 采用CTAB法對病原菌DNA進行提取。

1.5.2 PCR擴增病原菌內轉錄間隔區（ITS區） ITS-rDNA基因片段擴增采用通用引物，上引物為ITSF（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），下引物為ITSR（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。20 μL PCR擴增體系如下：1 μL DNA模板，0.5 μL 上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL預混液Mix，8 μL ddH2O。PCR反應程序如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環;72 ℃ 7 min。

反應完成后，取3 μL PCR產物，加1 μL 6×loading buffer，混勻后點樣于0.8%瓊脂糖凝膠，電泳后在紫外光下觀察特異性條帶。

1.5.3 PCR擴增產物的純化回收 PCR擴增產物經全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化。

1.5.4 ITS區基因的克隆轉化 將回收純化產物與T載體（PMD19-T）連接（載體與目的片段摩爾比為1 ∶ 3），然后轉化Escherichia coli感受態，篩選陽性克隆[13]，進行測序。

1.5.5 質粒提取及測序 篩選陽性克隆，于37 ℃搖床培養12 h，提取大腸桿菌質粒，送相關公司測序。質粒提取步驟參考溫建新等的大腸桿菌質粒提取方法[14]。ITS-rDNA測序由北京華大基因研究中心完成。將測序結果在美國國立生物技術信息中心（NCBI）數據庫中進行同源序列比對（BLAST），獲得重復率最高的相關屬及相關種的基因序列，并根據遺傳距離計算結果繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離篩選

以貯藏于冷庫的自然發病香梨及生長環境中采集的土壤、樹葉為材料，經分離篩選、純化，得到11株病原菌，其中從土壤中分離出1株（命名為TR-1），從樹葉中分離出5株（分別命名為SY-2、SY-3、SY-4、SY-5、SY-6），從病梨中分離出5株（分別命名為XL-2、XL-3、XL-4、XL-5、XL-6）。

通過觀察病原菌菌落形態，發現2株菌SY-6、XL-6在生長初期為灰白色，氣生菌絲薄層絮狀，隨著生長時間的延長及孢子的產生，逐漸表現為淺綠色直至褐色，菌落有明顯的同心輪紋，中心突起且泛白，質地緊致，呈氈狀，表面呈現溝紋狀，基底為墨綠色，生長后期培養基呈黑色，菌落邊緣處有1道寬約0.2～0.4 cm的白色菌絲體。這與筆者所在課題組前期研究結果，即黑頭病病原菌鏈格孢屬的菌落形態較接近，初步判定菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

2.2 病原菌的顯微觀察

通過對菌株進行顯微觀察，在高倍鏡下觀察孢子形態，由圖1可以看出，SY-6、XL-6病原菌孢子串生、有橫隔且孢子呈長卵形，與鏈格孢屬較為相似。

2.3 回接試驗

將分離純化得到的致病菌菌株（SY-6、XL-6）采用有傷回接（菌餅）法進行試驗，由圖2可知，接種后香梨的發病癥狀與自然發病香梨相似。2株致病菌于庫爾勒香梨上在生長初期為灰白色，氣生菌絲薄層絮狀，隨著生長時間的延長，逐漸變為淺綠色直至褐色，菌落有明顯的同心輪紋，中心突起且泛白，質地緊致、氈狀，表面呈現溝紋狀，基底為墨綠色，生長后期培養基呈黑色，菌落邊緣處有1道寬約0.2～0.4 cm的白色菌絲體。初步判定病原菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

2.4 黑頭病致病菌的分子生物學鑒定

2.4.1 致病菌的DNA提取及擴增 采用CTAB法提取菌株（SY-6、XL-6）的基因組DNA，并進行PCR擴增，以ITSF、ITSR通用引物擴增致病菌的ITS-rDNA，對PCR擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，PCR擴增產物均有條帶，且條帶單一，無其他雜帶出現，電泳結果見圖3，根據電泳圖中marker Ⅱ分子量大小的比對可知，致病菌的ITS-rDNA基因序列片段大約為600 bp。

2.4.2 PCR產物回收純化 將PCR擴增產物經全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化，并進行電泳檢測。由圖4可以看出，回收結果均有條帶，且條帶單一，回收效果良好。

2.4.3 克隆轉化及質粒提取 將純化后的DNA由T載體轉入大腸桿菌感受態細胞，進行抗生素藍白選擇性培養，成功挑選白色單菌落，于37 ℃搖床培養10～12 h后，提取質粒，質粒提取結果表明，SY-6、XL-6條帶清晰明亮，質粒提取較成功，電泳檢測結果見圖5。