細胞自噬在擬南芥應答鎘脅迫中的作用

管彬 周竹青

摘要：以擬南芥野生型（WT）、呼吸暴發氧化酶f（rbohf）突變體、細胞自噬2（atg2）突變體、atg5突變體和轉基因GFP-ATG8a為材料，利用遺傳學、細胞學手段分析細胞自噬在應答鎘脅迫中的作用。結果表明，鎘脅迫可以誘導野生型擬南芥根中活性氧（ROS）的積累;鎘脅迫誘導野生型擬南芥中自噬相關基因ATG2、ATG5、ATG7和ATG8a的表達以及自噬體的積累。進一步研究表明，在鎘脅迫處理后，atg突變體中自噬體的數量與野生型相比明顯降低，ROS水平卻顯著升高。上述結果初步表明，細胞自噬通過調節ROS應答鎘脅迫。研究結果為深入研究植物應答鎘脅迫的分子機制提供了依據。

關鍵詞：擬南芥;細胞自噬;鎘脅迫;活性氧

中圖分類號： Q945.78 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0090-06

鎘（Cd）是土壤重金屬污染的主要元素之一[1]，對植物的生長發育危害較大。在鎘脅迫發生時，首先影響植物根系，使線粒體、葉綠體等細胞器發生損傷，造成活性氧（ROS）的大量積累，產生氧化損傷，導致積累損傷蛋白質[2]。ROS是生物體有氧代謝產生的一類活性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和單線態氧（1O2）等[3]。在正常情況下，植物細胞內ROS的產生與清除處于動態平衡狀態，不會造成傷害。但是，環境脅迫能打破植物細胞內ROS的代謝平衡，導致ROS積累。在擬南芥中，ROS的一個重要來源是植物呼吸暴發氧化酶（RBOH），存在10個RBOH基因，分別是AtRBOHA～AtRBOHJ[4]。在鎘脅迫下，AtRBOHC、AtRBOHD、AtRBOHF基因調節ROS的代謝[5]。

細胞自噬是一種廣泛存在于真核細胞中、利用液泡或溶酶體降解細胞內損傷細胞器和蛋白的過程[6-8]。植物細胞自噬主要分為兩類：微自噬和巨自噬（下文涉及的細胞自噬為巨自噬）[9]。微自噬是指液泡膜內陷將底物包裹并降解的過程[10]。巨自噬是細胞接受信號誘導后，在胞內產生新月狀或者杯狀的自噬泡，包裹需要降解的細胞質和細胞器，形成自噬體并運往液泡降解[11]。目前人們已經在酵母中發現了32個參與細胞自噬過程的基因（ATG），在模式植物擬南芥中，也有超過30個ATG被發現[12]。在自噬體的形成中，有ATG8-PE連接體系和ATG5-12-16連接體系[13]。ATG8-PE連接體系主要負責ATG8與磷脂酰乙醇胺（PE）的類泛素化連接并定位在吞噬體膜上[14]。ATG8-PE從吞噬體膜的起始到被液泡降解，伴隨了整個細胞自噬的發生過程，因此ATG8被廣泛用作自噬檢測的標記蛋白[15]，而ATG5-12-16連接系統有促進ATG8-PE形成的功能[16]。

鎘脅迫可以產生氧化損傷，導致ROS和損傷蛋白質的積累[17]。在植物中，ROS可以通過誘導細胞自噬的發生而減少氧化損傷[18]。對野生型擬南芥外源施加ROS的誘導劑甲基紫腈（MV），可以誘導細胞自噬的發生。而用MV處理atg10b突變體后，引起氧化蛋白的大量積累，使其對氧化脅迫更為敏感[19-20]。另外有研究表明，擬南芥atg突變體中的ROS水平明顯較野生型中的ROS水平高[21]。ROS作為信號分子可以誘導細胞自噬的發生，從而減少ROS和損傷蛋白質對植物細胞的傷害。因此，有理由相信細胞自噬在鎘脅迫中有重要作用。目前，細胞自噬在鎘脅迫中的作用仍不清楚。本研究旨在通過遺傳學和細胞學手段來研究細胞自噬應答鎘脅迫的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥和atg2、atg5和rbohf突變體種子由筆者所在實驗室保存，轉基因GFP-ATG8a種子由華南師范大學陳文利教授惠贈。所有種子均經1%次氯酸鈉溶液表面消毒 12 min 后，用無菌水沖洗4～5遍，置于4 ℃冰箱3 d，然后點種在1/2 MS培養基上，垂直斜放在光—暗周期為16 h—8 h、光照度為120 μmol/（L·m2·s）、溫度為22 ℃、相對濕度為60%的培養箱內。

1.2 鎘脅迫處理

本試驗于2017年在華中農業大學生命科學技術學院細胞生物學實驗室進行。選擇在人工氣候培養箱中正常生長 5 d 左右的擬南芥，分別轉移至氯化鎘濃度為0、25、50 μmol/L 的MS培養基中進行鎘脅迫處理。轉移好后用封口膜封口，于22 ℃培養箱內處理2 d，測量擬南芥野生型和突變體的根長（n=20），設3次生物學重復，記錄數據。

1.3 自噬體觀察

將用GFP（綠色熒光蛋白）-ATG8e標記的擬南芥植株放于載玻片上，小心夾取，擺放端正，滴1滴蒸餾水于載玻片上，緩慢向下壓片，使細胞分布相對均勻。使用徠卡倒置共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的40×或20×水鏡或光鏡觀察擬南芥根的GFP熒光信號。GFP的激發波長為488 nm，發射波長為507 nm。

單丹磺酰尸胺（MDC）染色：將擬南芥完全浸入 50 μmol/L MDC染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色 10 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次。使用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的40×水鏡加上4′，6-二脒基-2- 苯基吲哚（DAPI）濾鏡觀察擬南芥根的MDC激發的熒光信號。MDC的激發波長為380 nm，發射波長為530 nm。

1.4 活性氧的檢測

用特異性ROS熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）觀察內源性ROS的水平。將擬南芥完全浸入10 μmol/L DCFH-DA染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色處理30 min，然后用PBS沖洗3次。使用倒置激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）的20×干鏡觀察擬南芥根的DCFH-DA激發的熒光信號。DCFH-DA的激發波長為488 nm，發射波長為605 nm。主要在相同參數設置下和相同gain值（用來表示熒光強度）下拍照。用Image pro plus 6.0測量其相對熒光強度。

1.5 RT-PCR分析

將新鮮的擬南芥組織用液氮研磨成粉末，用TRIzol抽提總RNA，最后將總RNA溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，簡稱DEPC）水中。用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒將分離的RNA反轉錄成cDNA。使用TaKaRa公司的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR擴增，每組試驗設3次技術重復和3次生物學重復。反應程序如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。試驗結果用2-ΔΔCT進行分析，以ACTIN2基因作為內參基因，熒光定量PCR反應的引物序列見表1。

1.6 數據分析

除了特別說明，所有試驗都重復3次及以上，本研究結果都以“x±s”表示。試驗數據采用Graphpad prism 7.0軟件的雙尾t檢驗進行分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫誘導活性氧的積累

為了研究ROS是否參與鎘脅迫，筆者利用ROS特異性探針DCFH-DA檢測鎘脅迫處理后野生型擬南芥根中ROS的變化。DCFH-DA染色結果顯示，鎘脅迫處理后的ROS含量在擬南芥根中明顯升高（圖1-A）。對3組重復試驗進行統計分析，發現用25、50 μmol/L CdCl2處理后的ROS含量分別是對照的1.33、2.37倍（圖1-B），這表明鎘脅迫誘導了ROS的產生。由于RBOHF基因參與了鎘脅迫下過氧化氫的產生，而過氧化氫是ROS的一種[5]。為了獲取ROS參與鎘脅迫的遺傳學證據，對野生型和rbohf突變體進行鎘脅迫處理。表型分析結果表明，生長在正常MS培養基上的野生型和rbohf突變體植株的表型沒有明顯差異;但是在添加 50 μmol/L CdCl2的MS培養基上處理2 d后，rbohf突變體的主根明顯比野生型的短（圖1-C）。根長的統計結果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，rbohf突變體的根長比野生型的減少了38%（圖1-D），這表明rbohf突變體對鎘脅迫敏感。

2.2 鎘脅迫誘導細胞自噬的發生

為了研究細胞自噬是否參與擬南芥的鎘脅迫，對CdCl2處理濃度分別為25、50 μmol/L的擬南芥進行取樣，利用熒光定量PCR技術檢測ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的相對表達水平。結果表明，鎘脅迫處理后，細胞自噬相關基因的相對表達水平明顯上升（圖2）。用25 μmol/L CdCl2處理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表達量分別是對照組的 2.04、3.40、2.81、5.82倍;用50 μmol/L CdCl2處理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表達量分別是對照組的3.93、7.76、 4.19、 12.86倍。 這些結果表明， 鎘脅迫誘導了細胞自噬基因的表達。為了進一步驗證上述結果，利用轉基因 GFP-ATG8a 幼苗來觀察自噬體。將用25、50 μmol/L CdCl2處理和正常條件下生長的植株直接放置在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。結果表明，鎘脅迫處理后的擬南芥根中有較多GFP-ATG8a標記的點狀或環狀的自噬體積累，而在對照中較少（圖3-A）。對3組重復試驗進行統計分析，發現用25、50 μmol/L CdCl2處理后的自噬體數分別是對照的8.89、13.32 倍（圖3-B）。

2.3 atg突變體對鎘脅迫敏感的表現

為了研究細胞自噬在鎘脅迫中的作用，用50 μmol/L CdCl2處理擬南芥野生型或細胞自噬突變體植株。結果表明，生長在正常MS培養基上的野生型和atg突變體植株的表型沒有明顯差異;但是在添加50 μmol/L CdCl2的MS培養基上處理2 d后，atg突變體的主根明顯比野生型短（圖4-A）。這表明atg突變體對鎘脅迫敏感。根長統計結果表明，鎘脅迫處理后，atg2、atg5突變體的根長分別比野生型減少了18%、28%（圖4-B）。為了進一步研究細胞自噬在鎘脅迫中的功能，對用50 μmol/L CdCl2處理的擬南芥野生型或細胞自噬突變體植株進行MDC染色。圖像分析結果表明，在正常MS培養基上生長時，野生型和atg突變體中的自噬體較少。用鎘脅迫處理后，野生型植株中的點狀或環狀結構自噬體數明顯增加，而atg突變體中的自噬體數沒有明顯變化（圖4-C）。3組重復試驗的統計結果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，野生型擬南芥中的自噬體數是對照的10.5倍，而atg突變體的自噬體數沒有明顯變化（圖4-D）。上述結果表明，atg突變體對鎘脅迫敏感。

2.4 atg突變體在鎘脅迫下活性氧的積累

為了研究細胞自噬與ROS的關系，用DCFH-DA檢測50 μmol/L CdCl2處理后，野生型、atg2和atg5幼苗中的ROS水平變化。染色結果顯示，在正常MS培養基上生長時，atg2、atg5突變體中的ROS含量與野生型沒有明顯差異。在遭受鎘脅迫處理后，野生型、atg2、atg5幼苗中的ROS含量明顯升高，atg2、atg5突變體中的ROS水平比野生型的高（圖5-A）。3組重復試驗的統計結果表明，用50 μmol/L CdCl2處理后，atg2、atg5突變體中的ROS含量分別比野生型的高2.40、2.29倍（圖5-B），這說明細胞自噬可以通過調控植物ROS的產生來應答鎘脅迫。

3 結論與討論

鎘是一種重金屬污染物，可以影響植物的生長發育[22-23]。當鎘脅迫發生時，植物會發生一系列生理生化改變來抵抗鎘脅迫[2]。ROS作為一種重要的信號分子，參與應答各種非生物脅迫。鎘脅迫使植物產生氧化損傷，促使ROS積累[17]。本研究結果表明，鎘脅迫處理后擬南芥根尖積累了大量的ROS。另外，由于RBOH是模式植物擬南芥ROS的最主要來源[5]，通過觀察rbohf突變體的表型發現，rbohf突變體對鎘脅迫敏感。這表明RBOHF可能參與鎘脅迫下ROS的產生。

細胞自噬在植物的生長發育和營養脅迫、氧化脅迫等脅迫中發揮著重要作用[24]。在植物中，細胞自噬能被非生物脅迫包括饑餓、氧化和滲透脅迫誘導[25]。同酵母一樣，煙草懸浮細胞在營養缺乏的條件下也能夠激活細胞自噬。對其進行饑餓處理會引起自噬相關基因ATG4a、ATG4b、ATG8a、ATG8i、ATG3、ATG7的表達水平升高[26]。本研究結果表明，鎘脅迫誘導細胞自噬相關基因ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a的表達。進一步觀察ATG8a-GFP轉基因植株，發現鎘脅迫處理后誘導了大量自噬體產生。這些結果表明，細胞自噬參與應答植物的鎘脅迫。另外，有研究表明，擬南芥atg7、atg9、atg4a4b、atg5、atg18a突變體對營養缺乏敏感[27]。筆者發現，atg2、atg5突變體在鎘脅迫下的生長被抑制，自噬體的形成減少，進一步說明細胞自噬在植物的鎘脅迫過程中發揮著重要的作用。干旱和滲透脅迫都可以造成植物細胞ROS的氧化蛋白的積累，而細胞自噬有清除氧化蛋白和ROS的能力[20]。本研究發現，鎘脅迫處理后，atg2、atg5突變體中的ROS含量都比野生型的高，說明細胞自噬可以清除細胞內的ROS。綜上表明，細胞自噬可能通過清除細胞內的ROS來抵抗鎘脅迫。

由于植物的鎘脅迫機制十分復雜，植物鎘脅迫中的許多問題仍未有解答。本研究為作物在鎘脅迫下的耐受性研究提供了理論依據，而關于細胞自噬在鎘脅迫中的作用還有待進一步研究。

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