南泥灣野生山丹丹組培快繁技術

王凱 王凱琪 常裕

摘要：為建立南泥灣野生山丹丹快繁和植株再生系統，并進一步為山丹丹試管內育種提供材料，以南泥灣林場后場采集到的野生山丹丹的鱗莖為材料，研究不同濃度6-BA對南泥灣野生山丹丹啟動培養的影響、不同6-BA與IBA濃度組合對其繼代培養的影響、IBA濃度對其組培苗生根的影響，并對生根苗進行了煉苗移栽。結果表明，（1）南泥灣野生山丹丹啟動培養的較佳培養基為MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+活性炭 0.2 g/L，9 d轉綠，21 d分化出了小鱗莖，分化率為84%;（2）較佳繼代培養基為MS+白砂糖30 g/L+瓊脂 5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培養25 d后，繁殖率（繁殖系數）為7.3;（3）較佳生根培養基為1/2 MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L+IBA 0.3 mg/L，培養25 d后，生根率為84%，以上培養基pH值均為6.8。用生根培養的山丹丹組培苗煉苗移栽成活率達到了100%。

關鍵詞：野生山丹丹;鱗莖;組織培養;植株再生;6-BA

中圖分類號： S682.2+90.4+3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0059-03

山丹丹，學名山丹（Lilium pumilum DC.），為百合科百合屬多年生球根花卉。山丹丹鱗莖含淀粉，供食用，也可入藥，有滋補強壯、止咳祛痰、利尿等功效?；r紅色，下垂。山丹丹是一種抗寒性很強的優良的百合屬種質資源，可用于培育抗寒耐旱的百合花品種[1-2]。南泥灣野生山丹丹（圖1）種質是延安大學山丹丹大學生創業團隊2013—2015年在南泥灣林場進行種質資源調查時發現的。南泥灣野生山丹丹種質相較于勞山種質有花色為橙紅色、上仰的特異性。山丹丹在自然狀態下繁殖系數小，人們對其保護意識不強、過度采挖以及生態環境的變化，導致野生山丹品質退化嚴重、數量稀少。

組織培養技術可以有效提高山丹丹繁殖效率、改善品質退化等。目前，已經建立山丹丹離體快繁再生體系，并對山丹丹組培苗的繼代培養、生根培養及移栽條件進行研究[3-5]。陜北地區山丹丹組培快繁研究僅有勞山山區的種質[6]，南泥灣種質并無報道。我們采用組培快繁的方法對南泥灣野生山丹丹進行快速大量繁殖，以期建立南泥灣野生山丹丹快繁和植株再生系統，解決該種質數量稀少的問題，并進一步為山丹丹試管內育種提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為2015年5月采自陜西省延安市寶塔區南泥灣林場后場的8顆野生山丹丹鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 啟動培養 將鱗莖外層腐爛鱗片剝除，鱗盤朝上用自來水沖洗2 min，用吸水紙吸干表面水分，放入超凈工作臺備用。再將啟動培養基、接種工具、0.1% HgCl2、吐溫20以及75%無水乙醇放入超凈工作臺備用，打開紫外燈和空氣快速殺菌消毒機（型號：LH-2000）滅菌30 min之后，在超凈工作臺上將鱗片剝下，用75%無水乙醇將鱗片浸泡30 s，無菌水清洗1 min。轉入0.1% HgCl2加1滴吐溫20，振蕩8 min，無菌水清洗3次，每次2 min，再用無菌濾紙吸干表面水分后的鱗片接種于啟動培養基上。每瓶接種1個鱗片，每個激素水平接種13瓶。先散光培養7 d，防止其失水褐化，后轉入光下培養。培養室溫度設置在（25±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

啟動培養基為：MS基本培養基+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8。6-BA濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L共4個水平，并加入NAA 0.01 mg/L和活性炭2 mg/L。

1.2.2 繼代培養 將初代培養中誘導出的小鱗莖，待其芽苗生長、抽出肥綠葉片之后，接入繼代培養基上進行培養，每瓶接入1個小鱗莖，每處理接10瓶，以30 d為1個培養周期。培養溫度（24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

繼代培養基為：MS基本培養基+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8。使用6-BA濃度0.8、1.0、1.2、1.4 mg/L 共4個水平，IBA濃度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4個水平的2因素4水平試驗。

1.2.3 生根培養 挑選生長健壯、無污染的繼代苗轉接進生根培養基，避光培養7 d后轉入光下培養。生根培養基：1/2 MS+白砂糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L，pH值為6.8，IBA濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4個水平。培養溫度 （24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相對濕度60%～75%。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA對山丹丹啟動培養的影響

接種后4個濃度處理的污染率分別為0%、7%、0%、7%（表1），均可滿足試驗需求。鱗片在啟動培養基上9 d左右呈現出轉綠情況，14 d左右邊緣呈現白色顆粒狀突起，21 d左右突起的部分分化出小鱗莖（圖2），隨后不斷長出葉片。每個鱗片上分化出了4～8個小鱗莖。啟動培養中統計結果（表1）表明，不同濃度6-BA的培養基中，鱗片的分化情況不同，總體為先升高后降低。轉綠率，6-BA濃度為 1.0 mg/L 時最高，1.5 mg/L時次之，0.1 mg/L 時最低。出芽率，當6-BA在1.0 mg/L濃度時最高，1.5 mg/L濃度時次之，0.1 mg/L時最低。所以認為在 6-BA濃度為1.0 mg/L時對南泥灣地區山丹丹啟動培養效果好。

2.2 6-BA與IBA對山丹丹繼代培養的影響

2.2.1 6-BA與IBA組合對繼代培養的影響 繼代培養 15 d 左右材料均分化出含有鱗片的葉（圖3），25 d時統計新生出芽數（以2葉片中間所夾的生長點為準），增殖系數見表2，不同處理下增殖系數呈現出不同的變化。F6處理下新生芽數最多，為73個，增殖系數達到最大，為7.3。其次為F7處理，新生芽有69個，增殖系數為6.90。再其次為F5處理，新生芽有52個，增殖系數為5.2。最差的是F1處理，只分化出3個新芽，增殖系數也只有0.30?？梢奆6處理下即6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L的6-BA與IBA組合較其他組合更有利于南泥灣地區山丹丹組培的繼代培養。

2.2.2 6-BA與IBA各自對繼代培養的影響 在不同培養基中，隨著6-BA濃度的增大，增值系數先增加后減小，在 6-BA 濃度為 1.0 mg/L 時達到最大值， 為 5.70。 隨著IBA的濃度增大，增值系數在0.2 mg/L時達到最大，為2.90。這2種外源激素對繼代培養的方差分析結果見表3，6-BA的F值為23.92，大于臨界值F0.05，所以6-BA的影響達到顯著水平;IBA的F值為0.18，未達顯著水平。

2.3 IBA濃度對山丹丹組培苗生根的影響

將繼代培養獲得的組培苗接種在IBA濃度不同的生根培養基上，10 d觀察到山丹丹鱗片基部有乳白色顆粒狀的愈傷組織形成，然后分化出根（圖4）。25 d后統計結果見表4，顯示所有IBA濃度下都有根生成，且IBA濃度對生根率、根長、生根條數和根的形態有影響。在IBA濃度為 0.3 mg/L 的水平下生根率達到最高，為84%，平均根長達到3.22 cm，平均根數5.3條，均優于其他3個水平;根的形態為基部膨大、端部細長。

3 煉苗移栽

3.1 煉苗

用高錳酸鉀溶液對栽培工具浸泡消毒。將生根培養獲得的組培苗挑選長出5～7張葉子、葉片最低高度達5 cm、生根數達5條以上、根長達到4 cm以上的生根苗進行煉苗。先將生根苗連同培養瓶一起置于移栽設施中放置7 d，然后打開瓶口再放置2～3 d。

3.2 移栽

將煉苗后成活的生根苗取出，清洗掉多余的培養基，定植在營養缽內，每個營養缽裝栽培基質100 g，栽種1株生根試管苗（圖5）。移栽后每7 d澆1/2MS大量營養液1次?？諝鉂穸缺３衷?0%～90%，遮光率50%，光照度（1 000±500） lx ，環境溫度控制在22～26 ℃。移栽過程每天觀察植株的生長情況，在小苗管理期間要經常噴水，防止爛根。每隔2～3周追1次稀薄液體肥料，定期噴灑殺菌劑，預防病害發生。經2個月的管理，待小苗長出5對以上新葉后即為移栽成活。調查結果表明，成活率為100%。

4 討論與結論

啟動培養是否成功與外植體選擇有很大關系。馬永紅等認為，以山丹丹器官作為外植體時分化能力由大到小為種子>鱗片>幼嫩莖段>葉片[7]。鑒于鱗片誘導不受季節因素影響，本次試驗選用南泥灣野生山丹丹鱗片進行誘導，發芽率達84%。鱗片易于誘導、繁殖系數高，但其后期污染率較高，要及時轉入新的培養基。劉冬云等篩選適合山丹丹的啟動培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L[8-9]。本試驗篩選的啟動培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，其中差異可能由材料的生態類型引起，還有待進一步研究。影響山丹丹生長發育的重要因素之一是植物生長調節劑的種類和濃度。van Aartrijk等認為，低濃度生長素和高濃度細胞分裂素的組合對百合鱗片分化有促進作用[10]。本試驗篩選出有利于南泥灣山丹丹繼代培養的外源激素濃度為1.0 mg/L 6-BA與濃度為0.2 mg/L的IBA組合，驗證了該結論。本試驗繼代培養中，對不定芽的增殖有決定性作用的是細胞分裂素，而生長素對不定芽葉片的生長分化有至關重要的影響。高濃度6-BA、低濃度IBA的培養基易于分化不定芽，而在一定的IBA濃度范圍內，增殖的芽數隨著6-BA濃度的提高而增長，但芽之間變得越發緊湊，適當增加IBA的濃度，不定芽葉片伸張，鱗莖也有所膨大。誘導生根一般需要降低無機鹽濃度，常使用低濃度的MS培養基[11]，本次使用1/2MS誘導出了根，但生根培養基中IBA濃度不宜過高，否則會產生愈傷組織，再在愈傷組織下面生出根，這樣的根容易掉落，不利于移栽。

以南泥灣野生山丹丹的鱗莖進行組培快繁得出以下結論：較佳啟動培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+AC 2 mg/L，此時出芽率達到84%;較佳繼代培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，增殖系數達到7.3;較佳生根培養基為1/2MS+IBA 0.3 mg/L，生根率為84%。以上培養基均附加白砂糖30 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH值均為6.8。用繼代培養的山丹丹組培苗煉苗移栽成活率達到100%。

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