蝦青素對牛子宮內膜細胞炎癥損傷的保護作用

張辰，譚秀文，魏晨，張相倫，靳青，劉桂芬，劉曉牧，萬發春

蝦青素對牛子宮內膜細胞炎癥損傷的保護作用

張辰1,2，譚秀文2，魏晨2，張相倫2，靳青2，劉桂芬2，劉曉牧2，萬發春1,2

（1山東師范大學生命科學學院，濟南 250014；2山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室/山東省肉牛生產性能 測定中心/山東省畜禽健康養殖工程技術中心，濟南 250100）

【】利用蝦青素較強的抗氧化特性，通過探討黏膜屏障重塑對脂多糖（LPS）誘導的牛子宮內膜細胞炎癥的影響，為牛子宮內膜細胞炎的預防和治療提供理論基礎。培養液中添加1 μg·mL-1LPS，培養子宮內膜細胞6 h，檢測培養液中炎癥因子TNF-α和IL-6含量，建立細胞的體外炎癥模型。在此基礎上去掉培養液，重新加入含1×10-6mol·L-1蝦青素的新鮮培養液，繼續培養細胞24 h。對照組為不添加LPS或AST，LPS組為僅添加LPS，AST組為添加LPS和AST。采用ELISA法檢測培養液中TNF-α和IL-6炎癥因子分泌量以及細胞SOD和CAT酶活性，利用流式細胞儀檢測細胞內活性氧簇（ROS）水平，利用免疫熒光染色檢測細胞緊密連接蛋白Claudin、CDH1、TJP1的分布情況，利用熒光定量RT-PCR法和Western Blot法分別檢測Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平。利用1 μg·mL-1LPS培養子宮內膜細胞6 h，檢測發現培養液中炎癥因子IL-6和TNF-α分泌水平顯著高于對照組（＜0.05），說明LPS誘導子宮內膜細胞產生炎癥反應。與對照組相比，細胞內ROS水平顯著增加（＜0.05），SOD和CAT酶活性都顯著降低（＜0.05），說明LPS誘導的子宮內膜細胞炎癥造成了氧化損傷。加入1×10-6mol·L-1蝦青素培養細胞24 h后，發現培養液中IL-6和TNF-α因子的分泌水平顯著低于LPS組（＜0.05），同時ROS陽性細胞比率顯著下降（＜0.05），SOD和CAT酶活性都顯著升高（＜0.05）。LPS組與對照組相比，細胞膜處Claudin、CDH1、TJP1蛋白的熒光信號減弱，這3種緊密連接蛋白的mRNA和蛋白表達水平也都顯著降低（＜0.05）。加入1×10-6mol·L-1蝦青素培養24 h后，與LPS組相比，在細胞邊緣和細胞核內可以檢測到熒光信號很強的Claudin、CDH1、TJP1蛋白，而且這3種緊密連接蛋白的mRNA和蛋白表達水平也都顯著升高（＜0.05）。蝦青素通過降低子宮內膜細胞因炎癥反應產生的氧化損傷，減輕炎癥導致的子宮內膜細胞緊密連接結構損傷，對子宮內膜的物理免疫屏障起保護作用，為牛子宮內膜炎的預防和治療提供理論借鑒意義。

牛；蝦青素；子宮內膜細胞；炎癥因子；緊密連接蛋白

0 引言

【研究意義】子宮內膜炎是牛場最常見的繁殖疾病之一，其主要影響牛的繁殖性能，造成流產、難孕甚至不孕，產犢間隔延長，從而導致其繁殖率降低，會造成嚴重的經濟損失。牛子宮內膜炎是發生在牛子宮內膜組織的病理過程。在牛場飼養管理過程中，多種因素會導致牛子宮內膜炎的發生，但病原微生物感染是引發本病的最主要原因，其中革蘭氏陰性菌是主要的致病菌種。目前，對于牛子宮內膜炎的治療普遍采用抗生素，但這樣可造成細菌的耐藥性增加，機體免疫力下降，以及奶、肉的藥物殘留問題。因此，研發安全、高效、綠色的新型飼用抗生素替代產品已迫在眉睫。【前人研究進展】蝦青素（Astaxanthin，AST）是一種酮式類胡蘿卜素，其廣泛存在于海洋生物、藻類、真菌及少數植物中。研究發現，蝦青素具有多種生物學效應，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化、提高機體免疫等。MEEPHANSAN等報道，蝦青素可通過降低小鼠機體氧化應激促進皮膚傷口愈合[1]。ALAM等利用異丙腎上腺素制作大鼠心肌梗死和心臟肥大模型，發現蝦青素處理可防止心臟濕重增加，減少炎癥細胞浸潤和纖維化[2]。MENG等利用Cu2+誘導前列腺細胞系（RWPE-1）凋亡，發現蝦青素處理后可保護細胞免受Cu2+誘導的氧化損傷[3]。【本研究切入點】由于炎癥通常是自由基導致的氧化損傷所致，而蝦青素是已經發現的最強、最高效的天然抗氧化劑之一。雨生紅球藻中蝦青素的抗氧化活性是β-胡蘿卜素的10倍、維生素E的550倍，被稱為超級維生素。【擬解決的關鍵問題】基于蝦青素較強的抗氧化特性，本試驗利用細菌脂多糖（LPS，其主要成分是革蘭氏陰性菌細胞壁）建立牛子宮內膜細胞炎癥損傷模型，研究蝦青素對炎癥的反應，為蝦青素在疾病預防和炎癥治療方面的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2017年至2018年在山東省農業科學院畜牧獸醫研究所進行，所有生物材料和試劑保存于山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室。

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12培養基（Gibico公司）、胎牛血清（Biological Industries公司）、0.25%Trypsin- EDTA（Sigma公司）、蝦青素（Sigma公司）、LPS（Gibco公司）、Penicillin-Streptomycin（北京Solarbio公司）、CCK-8溶液（上海碧云天生物技術有限公司）、DMSO（德國WAK公司）、血清白蛋白BSA（Sigma公司）、引物（濟南鉑尚生物）、TRIzon Reagent（康為世紀生物科技有限公司）、Hiscript ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（南京諾唯贊生物科技有限公司）、Cham QTM SYBR Color qPCR MasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）、ELISA試劑盒（上海朗頓生物）。

1.1.2 主要儀器 CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）、倒置相差顯微鏡及全自動顯微攝像裝置（日本Nikon公司）、酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）、高速冷凍離心機（德國Sigma公司）、熒光定量PCR儀（羅氏醫學儀器公司）、流氏細胞儀（美國BD公司）、激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理 牛子宮內膜細胞系（BEND）購自上海冠導生物工程有限公司，其建系于1997年，取自美國拉勒米懷俄明州發情第14天的荷斯坦奶牛子宮內膜。按照常規方法將復蘇的細胞放入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12培養液中，置于38.5℃、5% CO2的細胞培養箱內培養，待細胞生長至貼壁80%—90%時用0.25%胰酶消化傳代。根據不同的試驗目的，分別將細胞移入6孔細胞板或96孔細胞板中繼續培養，隨機分為3組：對照組、脂多糖組（LPS組）和蝦青素保護組（LPS+AST組），每組設置6個平行樣本。待細胞貼壁80%—90%后，去除原有細胞培養液，LPS組和LPS+AST組加入終濃度為1 μg·mL-1的LPS培養液，對照組加入新的培養液。LPS作用6 h后，LPS+AST組更換為含1×10-6mol·L-1AST的培養液，LPS組和對照組更換為不含AST的相同培養液，繼續培養24 h。

1.2.2 ELISA法檢測炎癥因子含量 處理結束后收集培養液，10 000×g離心5 min取上清液，分別用于檢測培養液中炎癥因子IL-6 和TNF-α含量。按照ELISA試劑盒說明書操作，分別將標準品、待測樣品各100 μL加入酶標板孔中，保留兩個空白孔，37℃孵育90 min，洗板5次。除空白孔外，每孔加入50 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，洗板5次；除空白孔外，加入100 μL酶結合物工作液，37℃避光孵育30 min，洗板5次；加入100 μL顯色底物，37℃避光孵育15 min；加入100 μL終止液，混勻后用酶標儀檢測450 nm的吸光度，經空白校準后繪制標準曲線并計算樣品蛋白濃度。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞內ROS 用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次，加入1 mL DCFH-DA染液重懸細胞，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次。利用流式細胞儀上機檢測細胞熒光強度，以Cell Quest軟件分析平均熒光強度。

1.2.4 抗氧化酶（SOD、CAT）活性測定 用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次，將細胞混懸于RIPA裂解液，冰上放置30 min，4℃、12 000×g離心10 min，收集細胞裂解液。按照試劑盒說明書中所述步驟操作，最后在酶標儀450 nm處檢測吸光度，并繪制標準曲線，根據標準曲線計算SOD和CAT活性。

1.2.5 緊密連接蛋白免疫熒光染色 將細胞按1×104個/mL接種到激光共聚焦專用培養皿中，待貼壁至80%—90%時，用PBS洗滌1次，加入4%多聚甲醛4℃固定30 min。將多聚甲醛去除，加入預冷的PBS洗3次，每次5 min。加入含0.1% Triton X-100的PBS透膜處理10 min，PBS洗3次，每次5 min。加入含3% BSA的PBS，常溫封閉2 h。去除封閉液后加入一抗，分別是兔抗Claudin多克隆抗體（1﹕1 000，4933T，CST）、兔抗CDH1多克隆抗體（1﹕1 000，4068S，CST）和兔抗TJP1多克隆抗體（1﹕500，10804，SANTA CPUZ），4℃孵育過夜。去除一抗，PBS洗3次，每次5 min。加入二抗，Cy3連接的山羊抗兔IgG（1﹕200；Jackson Immuno Research），室溫避光孵育1 h。去除二抗，PBS洗3次，每次5 min。加入0.01 mg·mL-1Hoechst33342染色10 min，PBS洗3次，每次5 min。加入熒光防淬滅液，用激光共聚焦顯微鏡（Leica）觀察并采集數據。Hoechst和Cy3分別用藍色二極管（405 nm）和氦/氖激光管（543 nm）激發，同時采集相應帶寬的發射光分別為420—480 nm（Hoechst）和560—605 nm（Cy3），對應偽彩分別為藍色和紅色。采用相同的參數進行成像，并采集原始照片，然后將這些照片用Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics Inc.，Silver Spring，MD）在固定的參數下進行總熒光強度分析。將對照組的熒光值設為1，其他各組細胞的熒光值為與對照組的比值。

1.2.6 熒光定量RT-PCR法檢測緊密連接的mRNA表達水平

（1）引物設計 利用Primer 5.0軟件設計PCR引物（表1），由鉑尚生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物序列參數

（2）細胞總 RNA 的提取 采用北京康為世紀生物科技有限公司試劑盒（RNApure超純總RNA快速提取試劑盒）按照說明書提取細胞總RNA。細胞處理結束后去掉培養液，加入PBS洗1次，每孔加入1 mL Trizol試劑裂解細胞，加入0.2 mL氯仿，4℃，12 000× g離心10 min，吸取上層水相，加入水相體積一半的無水乙醇混勻，室溫放置10 min后于4℃，12 000×g離心15 min。棄上清液緩慢加入1 mL 用DEPC水配制的75%乙醇洗滌，于4℃，7 000×g離心5 min。RNA沉淀于室溫風干10 min，加入30 μL的1%DEPC水溶解。采用 One Drop測定樣品總RNA的濃度和純度。

（3）cDNA 的合成 采用諾唯贊試劑盒（HiScript?II Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) Kit）按照說明書進行 cDNA 的合成。在RNase-free的0.5 mL PCR管中配制混合液，42℃孵育2 min；加入5× HiScript II qRT SuperMix II，用移液槍輕輕吹打混勻；于50℃ 15 min，85℃ 5 s，迅速置于冰上終止反應得到cDNA，-20℃保存備用。

（4）Real-time PCR 按Real-time PCR試劑盒說明書進行操作，采用20 μL反應體系：SYBR Premix 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 6 μL。PCR擴增條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；反應40個循環。設置β-actin作為內參，以2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.2.7 Western Blot法檢測緊密連接的蛋白表達水平 處理結束后去掉培養液，加入PBS洗1次，加入細胞裂解液置于冰上操作。反復吹打收集裂解液，4℃，12 000 ×g離心10 min，吸取上清液。利用BCA法測定蛋白濃度，用裂解液將所有樣品稀釋至同等濃度，加入SDS上樣緩沖液100℃孵育5 min，以5%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE電泳。結束后將蛋白條帶電轉至PVDF膜上，加入封閉液室溫孵育1 h，加入一抗4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。取出PVDF膜，加入化學發光檢測液室溫避光孵育2 min，使用凝膠成像系統拍照。采用Quantity One軟件進行灰度分析，目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.3 數據分析

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。所有數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析LSD法進行統計處理，當＜0.05時表示差異顯著。

2 結果

2.1 蝦青素對子宮內膜細胞炎癥因子分泌的影響

以LPS處理子宮內膜細胞建立體外炎癥模型，由圖1可知，1 μg·mL-1LPS作用子宮內膜細胞6 h顯著提高IL-6和TNF-α蛋白的分泌水平（＜0.05）。在LPS造成細胞損傷的基礎上，加入1×10-6M 蝦青素作用細胞24 h，IL-6和TNF-α蛋白的分泌水平顯著下降（＜0.05）。說明蝦青素降低LPS誘導的子宮內膜細胞炎癥反應。

圖1 蝦青素對LPS誘導的子宮內膜細胞IL-6和TNF-α水平的影響

2.2 蝦青素對子宮內膜細胞氧化應激的影響

利用流式細胞儀檢測子宮內膜細胞內ROS水平，結果（圖2）發現，LPS作用6 h導致細胞內ROS水平增加（＜0.05），SOD和CAT酶活性都顯著降低（＜0.05）；再加入蝦青素作用24 h后， ROS陽性細胞比率顯著下降（＜0.05），SOD和CAT酶活性都顯著升高（＜0.05）。說明蝦青素降低細胞內ROS形成，提高抗氧化酶系統活性，保護細胞免受LPS導致的氧化應激損傷。

2.3 蝦青素對子宮內膜細胞緊密連接蛋白分布的影響

利用免疫熒光染色檢測子宮內膜細胞緊密連接蛋白Claudin、CDH1、TJP1分布情況，結果（圖3）發現，Claudin、CDH1、TJP1主要分布在子宮內膜細胞的細胞膜。用LPS作用6 h后，細胞膜處的Claudin、CDH1、TJP1的熒光信號減弱，說明此蛋白的含量減少，并且可見在子宮內膜細胞邊緣分布紊亂、無清晰的輪廓；而再加入蝦青素作用24 h后，在細胞邊緣和細胞核內可以檢測到熒光信號很強的Claudin、CDH1、TJP1，且在細胞邊緣分布均勻。說明蝦青素能緩解LPS導致的緊密連接蛋白在子宮內膜細胞上分布異常和含量降低。

2.4 蝦青素對子宮內膜細胞緊密連接基因mRNA表達的影響

利用熒光定量RT-PCR法檢測Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表達水平，結果（圖4）發現，與對照組相比，LPS處理顯著降低子宮內膜細胞Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表達（＜0.05），加入蝦青素作用后Claudin、CDH1、TJP1的mRNA表達顯著高于LPS處理組（＜0.05）。說明在mRNA水平上，蝦青素提高子宮內膜細胞因LPS刺激導致的緊密連接表達降低。

圖2 蝦青素對LPS誘導的子宮內膜細胞氧化狀態的影響

Fig. 2 Effect of astaxanthin on oxidative status in LPS- induced endometrial cells

圖3 蝦青素對LPS誘導的子宮內膜細胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白分布的影響

2.5 蝦青素對子宮內膜細胞緊密連接蛋白表達的影響

利用Western Blot法檢測Claudin、CDH1、TJP1蛋白表達水平，結果（圖5）發現，與對照組相比，LPS處理顯著降低子宮內膜細胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白表達（＜0.05），加入蝦青素后Claudin、CDH1、TJP1蛋白表達顯著高于LPS處理組（＜0.05）。說明蝦青素能修復LPS導致的子宮內膜細胞緊密連接結構損傷，對子宮內膜屏障起保護作用。

圖4 蝦青素對LPS誘導的子宮內膜細胞Claudin、CDH1、TJP1基因表達的影響

圖5 蝦青素對LPS誘導的子宮內膜細胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白表達的影響

3 討論

大腸桿菌等革蘭氏陰性菌是奶牛子宮內膜炎的重要致病菌，而位于細胞壁外膜上的LPS是激活機體免疫應答的重要物質，也是引起炎癥的關鍵細胞毒性因子，在體內激活多種炎癥信號通路，促使機體分泌炎性因子抵御炎癥反應[4-6]。參與免疫反應的早期和炎癥反應各階段的許多分子包括：TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等[7-9]。其中TNF-α和IL-6都是主要的促炎癥細胞因子，在很多疾病的發生和轉化中起到了重要作用。研究表明，TNF-α是前期炎癥反應中最先產生并且起到最關鍵作用的炎癥因子[10-12]。它具有十分廣泛的生物活性，引發一系列炎癥介質的產生，進而造成炎性因子的瀑布效應，是導致許多疾病生物學變化的重要遞質。TNF-α分泌量是炎癥病理過程中嚴重程度的標志，對疾病的發生具有調節和介導作用[13]。IL-6同樣具有多種生物活性，參與機體的炎癥反應，能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能[14-16]。GHASEMI等報道，亞臨床子宮內膜炎奶牛子宮內膜組織中，TNF-α、IL-6和IL-8的水平遠高于正常奶牛[17]。KASIMANICKAM等報道，臨床上患子宮內膜炎的荷斯坦奶牛，血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著高于正常奶牛[18]。KIM等報道，奶牛子宮積液中TNF-α、IL-6和IL-10水平顯著正常奶牛[19]。這些都說明奶牛子宮內膜炎的嚴重程度與機體中炎癥細胞因子的水平有重要關系。本研究發現，利用1 μg·mL-1LPS處理奶牛子宮內膜細胞6 h后，IL-6和TNF-α的分泌量顯著升高，說明奶牛子宮內膜細胞已發生炎癥反應，其炎癥模型構建成功。

蝦青素作為自然界存在的一種高度活性的化合物，具有增強機體局部和全身免疫的能力，抵抗機體炎癥，這種抗氧化性與免疫調節特性相結合，在防止疾病發生與傳播中發揮重要作用。OTTON等對大鼠采取灌胃的方式飼喂蝦青素和魚油，其中魚油作為多不飽和脂肪酸誘導機體發生氧化應激，結果發現蝦青素降低活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞中ROS水平，提高SOD、GPx等抗氧化酶活性，降低脂質和蛋白質的氧化損傷程度以及炎癥因子IL-1β水平，說明蝦青素能增強機體的免疫調節能力，并降低氧化損傷[20]。WAKABAYASHI等利用蝦青素飼喂大鼠4周，然后添加葡萄糖酸氯己定繼續飼喂，其中葡萄糖酸氯己定誘導腹膜纖維化，結果發現蝦青素降低腹膜厚度、8-羥基-2'-脫氧鳥苷水平以及TNF-α和IL-1β水平，說明蝦青素通過降低氧化損傷和抑制炎癥反應預防腹膜損傷[21]。ISLAM等利用四氯化碳（CCl4）構建大鼠肝損傷模型，然后飼喂蝦青素進行治療，結果發現蝦青素降低機體丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和高級蛋白質氧化產物（APOP）水平，提高CAT和SOD活性，并且阻止炎性細胞浸潤，說明蝦青素通過抑制脂質過氧化、激活抗氧化系統以及防止炎癥反應保護肝損傷[22]。本研究結果表明，蝦青素顯著降低奶牛子宮內膜細胞ROS水平，提高SOD和CAT的酶活性，降低IL-6和TNF-α分泌水平，說明蝦青素可以降低LPS產生的氧化應激以及抑制炎癥反應。

正常情況下，黏膜屏障由上皮細胞以及上皮細胞緊密連接等組成，可阻止致病微生物及毒素等大分子物質通過，是防止感染、參與機體免疫的第一道屏障[23-24]。緊密連接普遍在于脊椎動物的上皮及粘膜中，在防止病原體入侵中起到重要作用。常見的緊密連接蛋白有claudin、occludin、ZO-1等[25]。研究發現，大量炎癥因子或介質可損傷上皮細胞，影響上皮細胞緊密連接蛋白的表達及分布，破壞黏膜屏障的完整性和功能穩定，進而導致疾病的發生。因此，黏膜結構中緊密連接蛋白的研究也受到許多學者的重視。WU等報道，蘋果花青素提取物可減輕LPS誘導的Caco-2細胞氧化應激和炎癥反應，緊密連接蛋白如occludin、ZO-1等表達升高[26]。CHO等利用石榴預飼喂大鼠，然后暴飲酒精誘導腸道穿孔和炎癥性肝損傷，發現石榴預處理恢復腸道緊密連接蛋白如ZO-1、occludin、claudin-1和claundin-3的表達水平，降低酒精誘導的腸道屏障功能障礙、血漿內毒素和炎性肝病[27]。KAWABATA等利用葡聚糖硫酸鈉構建小鼠結腸炎模型，飼喂柑橘果皮粉末后發現，炎癥細胞因子表達降低，結腸的緊密連接蛋白如occludin、ZO-1、連接黏附分子-A表達升高，說明果皮粉有助于抑制小鼠結腸炎癥，保護腸道黏膜屏障[28]。CHEN等研究發現，缺乏維生素D可以引起claudin-2，claudin-4和claudin-12的mRNA和蛋白水平顯著降低[29]。本研究結果表明，蝦青素提高子宮內膜細胞中緊密連接蛋白如Claudin、CDH1、TJP1的表達，減輕了LPS導致的子宮內膜細胞緊密連接結構損傷，對子宮內膜屏障起保護作用。

4 結論

通過構建牛子宮內膜細胞炎癥模型，將蝦青素作用于炎癥細胞，發現蝦青素對于增強牛的黏膜屏障功能有顯著的效果。

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Protective Effect of Astaxanthin on Inflammatory Injury of Endometrial Cells in Bovine

ZHANG Chen1,2, TAN XiuWen2, WEI Chen2, ZHANG XiangLun2, JIN Qing2, LIU GuiFen2, LIU XiaoMu2, WAN FaChun1,2

(1College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014;2Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding/ Shandong Provincial Testing Center of Beef Cattle Performance/Shandong Provincial Engineering Technology Center of Animal Healthy Breeding, Jinan 250100)

【】The purpose of this study was to examine whether astaxanthin with strong antioxidant properties could protect endometrial cells against lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory injury through mucosal barrier remodeling, so as to provide a theoretical basis for the prevention and treatment of bovine endometritis. 【】The endometrial cells were cultured in the medium supplemented with 1 μg·mL-1LPS for 6 h, then the inflammatory factors (such as TNF-α and IL-6) in the cultured medium were detected to establish an inflammation model. On this basis, the cultured medium was removed and fresh culture medium containing 1×10-6mol·L-1astaxanthin was exchanged, and endometrial cells were further cultured for 24 hours. The control group was not added with LPS or AST, the LPS group was only added with LPS, and the LPS+AST group was added with LPS and AST. The inflammatory factors of TNF-α and IL-6 in the cultured medium and the activities of cellular SOD and CAT enzymes were detected by ELISA. The levels of reactive oxygen species (ROS) in the cells were detected by flow cytometry, and the distribution of tight junction protein, such as Claudin, CDH1 and TJP1, were observed by immunofluorescence staining. The mRNA and protein expression were examined by using fluorescence quantitative RT-PCR and Western Blot, respectively. 【】The endometrial cells were cultured in the medium supplemented with 1 μg·mL-1LPS for 6 h, the production of IL-6 and TNF-α in the cultured medium were significantly higher than those in the control group (＜0.05), indicating that LPS induced inflammation of endometrial cells. Compared with the control group, the level of intracellular ROS significantly increased (＜0.05), and the activities of cellular SOD and CAT enzymes significantly decreased (＜0.05), which indicated that LPS-induced inflammation in endometrial cells caused oxidative damage. When endometrial cells were further cultured in the medium containing 1×10-6mol·L-1astaxanthin for 24 h, the levels of IL-6 and TNF-α in cultured medium were significantly lower than those in LPS group (＜0.05), the percentage of ROS positive cells decreased significantly (＜0.05), and the activities of SOD and CAT enzymes increased significantly (＜0.05). Compared with the control group, the fluorescence signals of Claudin, CDH1 and TJP1 proteins in the LPS group were weakened, and the levels of the mRNA and protein expression of tight junction proteins also decreased significantly (＜0.05). However, when compared with the LPS group, Claudin, CDH1 and TJP1 proteins with strong fluorescence signals were detected in cell margin and nucleus in LPS+AST group, and the levels of mRNA and protein expression also significantly increased (＜0.05).【】Astaxanthin reduced the oxidative damage which caused by inflammatory of endometrial cells, relived the structure damage of tight junction proteins in endometrial cells, which might protect the physical immune barrier of endometrium and provided theoretical reference for the prevention and treatment of bovine endometritis.

bovine; astaxanthin; endometrial cells; inflammatory factors; tight junction protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.012

2018-12-10；

2019-05-09

國家自然科學基金（31802062）、現代農業（肉牛牦牛）產業技術體系建設專項資金（CARS-37）、山東省農業科學院農業科技創新工程（CXGC2018E10）

張辰，Tel：18505440868；E-mail：zcsdnu@163.com。譚秀文，Tel：18615638322；E-mail：lafta@sina.com。譚秀文與張辰為同等貢獻作者。通信作者萬發春，E-mail：wanfc@sina.com

（責任編輯 林鑒非）