黃顙魚體表潰爛癥初步研究

楊移斌，姜 蘭，宋 懌，董 靖1,，胥 寧1,，艾曉輝1,

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2.農業部漁用藥物創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣州 510380；3.農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)是我國重要的特種水產養殖品種之一，因其肉質鮮美，營養豐富，深受廣大消費者喜愛。在經濟利益的推動下，我國水產科技工作者突破了黃顙魚人工繁育，甚至培育出全雄黃顙魚，給養殖戶提供了充足的苗種需求，使得養殖規模及區域不斷擴大，養殖產量不斷攀升，滿足了市場的需求。在如此形勢下，養殖黃顙魚也遇到不少困難，其中之一就是病害問題，直接導致黃顙魚養殖失敗案例比比皆是。目前黃顙魚病害主要分為兩大類，一類是生物病原性疾病，主要包括細菌性疾病[1]、真菌性疾病[2]、寄生蟲寄生疾病[3]及病毒病[4]等；二類是非生物引起的疾病，主要包括環境、營養不適以及人工操作不當等導致的疾病[5]。病害問題成為了養殖黃顙魚需要急切突破的技術瓶頸。

2018年9-10月，浙江湖州某養殖場黃顙魚出現體表潰爛癥，發病率很高，而且造成養殖黃顙賣相不好，價格低，給養殖戶造成了重大經濟損失。本研究就該病進行流行病學調查，病因確定及防治藥物進行初步篩選，以期為黃顙魚體表潰爛病防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚

體表具有典型潰爛癥的黃顙魚采自浙江湖州某黃顙魚養殖場；感染用黃顙魚(30±2)g購于武漢江夏某養殖場，所購黃顙魚體表無明顯傷痕，體格健壯游泳能力強，在玻璃缸內暫養7 d后開展試驗。

1.1.2 試驗試劑

試劑：TCBS瓊脂、營養肉湯、營養瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、MH瓊脂、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒購自solarbio公司；2×Taq PCR Mix、引物合成、膠回收試劑盒、PMD-19T載體、瓊脂糖H及測序服務均由上海生工提供；尼泊金乙酯、丙酸鈣、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉及硫酸銅(均為化學純)均為國藥集團(上海)化學試劑集團出品。

儀器：PCR儀、恒溫干燥箱、高壓滅菌鍋、離心機、冰箱、無菌操作臺以及電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調查

對發病黃顙魚養殖場內外環境進行調查，并檢測發病水溫、水質及水源是否出現污染等情況，向養殖戶詢問養殖黃顙魚發病情況、以往病例以及用藥情況。現場對病魚進行解剖，觀察發病黃顙魚鰓部及主要內臟器官有無寄生蟲，是否出現腫大、充血等病變。就本次黃顙魚發病情況，取具有體表潰爛典型癥狀的病例進行液氮凍存，帶回實驗室進行下一步分析。

1.2.2 病原分離

取具有典型潰爛癥(如圖1所示)的黃顙魚5尾，在其未潰爛處表面使用75%酒精進行噴灑消毒處理，用無菌刀片刮下潰爛肌肉，無菌去掉污物后，取5小塊(0.8 cm×0.3 cm×0.2 cm)潰爛肌肉置于5個PDA平板上，同時使用經酒精燈灼燒后的接種環蘸取潰爛組織，劃線于TCBS及普通營養瓊脂平板上，將PDA平板置于25 ℃恒溫培養箱中培養24～36 h，將TCBS及普通營養瓊脂平板放置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h。PDA板上的菌株進行接種純化，最終長出單一的霉菌，接種于斜面培養基上進行干燥冷凍保存，暫命名HSZJ01。同時挑取TCBS及普通營養瓊脂平板上形狀、大小及顏色基本一致的菌落進一步純化，獲得分離菌株的純培養物，加入15%的甘油混勻后置于-80 ℃保存，分別暫命名為HSZJ02、HSZJ03。

圖1 發病黃顙魚癥狀Fig.1 Symptoms of P.fulvidraco

1.2.3 人工感染

1.2.3.1 分離株HSZJ01對黃顙魚的致病性研究

將分離株HSZJ01接種于PDA平板上，25 ℃培養48 h，使得菌絲長的鋪滿平板，置于4 ℃備用。

將60尾黃顙魚分到兩個玻璃缸進行養殖，即A組和B組，每組共30尾，每尾黃顙魚均在體表輕微割傷，以不出血為準。參照孫琪等水霉浸泡感染方法[6]，取數個長滿菌絲的平板去掉培養皿后，將帶培養基的菌絲放入濾網中，置于A組養殖水體，使水體孢子濃度達到104個/mL，而B組正常養殖，不加入菌絲。養殖條件：連續充氧，水溫(25±2)℃，pH 6.8～7.5，其他水質指標符合漁業生產標準。定時觀察A、B組的黃顙魚活動情況，體表是否出現異常等，及時記錄，并對可能瀕死的黃顙魚進行解剖觀察。

1.2.3.2 分離株HSZJ02、HSZJ03對黃顙魚的致病性研究

將分離株HSZJ02、HSZJ03菌株接種于普通營養瓊脂培養基上，同置于28 ℃恒溫培養24 h。

將感染用黃顙魚分為4組，每組30尾，分別為C、D、E、F組，其中C、E組養殖用水中分別加入分離菌株HSZJ02、HSZJ03，使其濃度分別達到104、105CFU/mL，而對照D、F組正常養殖，每尾黃顙魚均在體表輕微割傷，以不出血為準。養殖條件與1.2.3.1相同。定期觀察黃顙魚游泳狀況，對發病死亡魚進行解剖觀察，并進行細菌再分離。

1.2.4 分離株HSZJ01分子鑒定

參照動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明進行HSZJ01總DNA提取，提出的總DNA即作為PCR模板。引物ITS1: 5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4:5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC3′[7]。PCR反應體系：2×Taq PCR Mix 50 μL、ddH2O 47 μL、引物各1 μL及模板1 μL ；反應條件：95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；35個循環； 72℃延伸10min，4℃。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠驗證為目的片段后進行切膠，并進行膠回收。將膠回收產物連接到pMD-19T 載體上，再轉化大腸桿菌感受態內，涂板后挑出單克隆并進行陽性驗證，將陽性克隆送上海生工測序。

1.2.5 藥物篩選

1.2.5.1 抗生素篩選

藥敏實驗采用紙片瓊脂擴散法，參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實驗執行標準進行[8]。將分離菌株HSZJ01接種于液體PDA培養基中，使得孢子濃度達到102個/mL，再取200 μL均勻涂布于PDA平板上，后貼上不同的藥敏紙片25 ℃培養36 h后測量藥物抑菌圈直徑，結果用平均直徑±SD表示。

1.2.5.2 消毒劑篩選

將尼泊金乙酯、丙酸鈣、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉及硫酸銅等化學藥物均配制成100 mg/mL的溶液，裁剪8 mm圓形紙片浸泡于各溶液中24 h，即制成藥敏紙片，置于4 ℃備用。將分離菌株HSZJ01接種于液體PDA培養基中，使得孢子濃度達到102個/mL，再取200 μL均勻涂布于PDA平板上，后貼上不同的藥敏紙片25 ℃培養36 h后測量藥物抑菌圈直徑，結果同樣用平均直徑±SD表示。

2 結果

2.1 流行病學調查結果

本次發病的養殖場位于浙江湖州，湖州是國內黃顙魚主要集中養殖地，規模達數千公頃。此次發病水面約0.7 hm2，屬黃顙魚精養池塘，周邊池塘養殖的也多是黃顙魚，發病率約60%，死亡率近40%，發病規格多為100～200 g的商品魚，并且因潰爛癥在魚體表，影響美觀，影響銷售，給養殖戶造成巨大經濟損失。經臨床診斷發現發病魚體表潰爛明顯，甚至爛穿漏出內臟，鰓部有充血跡象，肝臟脂化嚴重，肝腎脾無充血，無腫大，亦未發現寄生蟲，但取潰爛肌肉組織進行鏡檢發現有菌絲存在。現場水質檢測結果為水溫24 ℃，pH 8.5，氨氮0.3 mg/L，亞硝酸鹽0.05 mg/L。據調查，黃顙魚暴發此類疾病在一年的養殖周期主要有兩個時間段，一是5月中旬-6月底，二是9月中下旬-10月下旬，水溫多在18～25 ℃，而水溫達到30 ℃以上則基本不發病。養殖在預防治療此類疾病時，多采取調節水質，外用碘制劑消毒，內服氟苯尼考或者恩諾沙星等藥物的方案，效果往往不是很理想，但當消毒劑中添加硫酸銅，效果較好。

2.2 分離菌株人工感染及分子鑒定

經人工感染試驗，發現使用3株分離菌株浸泡割傷的黃顙魚，僅HSZJ01浸泡實驗組黃顙魚出現體表嚴重潰爛，發病率為66.67%，與自然發病癥狀類似，鏡檢可以在其潰爛肌肉中明顯發現菌絲，并從感染發病黃顙魚體內再次分離到菌株HSZJ01，表明分離株HSZJ01是黃顙魚此次發病的病原。

將分離菌株HSZJ01的ITS序列放入NCBI中進行blast比對，結果顯示HSZJ01與不規則毛霉(Mucorirregularis)同源性最高，通過構建系統發育樹分析(圖2)，其結果顯示HSZJ01與不規則毛霉聚為一支。因此判定HSZJ01為不規則毛霉。

2.3 藥物篩選

本次選取了5種抗生素以及6種消毒劑作為試驗藥物，結果顯示抗生素中兩性霉素對HSZJ01抑菌效果最好，而消毒劑中硫酸銅抑菌效果最佳，具體見表1。

3 討論

隨著水產養殖的發展，水產動物病害日益增多，而養殖動物體表潰爛癥在養殖過程中廣泛流行。目前已經報道的患過此類疾病的養殖品種有鰻鱺(Anguillajaponica)[9]、黃鱔(Monopterusalbus)[10]、黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco[11]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、石斑魚(Epinephelussp)[13]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[14]、泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)[15]、諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)[16]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[17]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[18]等，主要癥狀以體表潰爛為主，潰爛部位不定，主要是肌肉潰爛，發病個體無規格差異，無地區差異，但因養殖品種、養殖環境以及地理因素等，導致發病的病原多種多樣，有真菌[9]、細菌[11]以及浮游生物[19]等等。因水產養殖動物體表潰爛癥病情復雜多變，給防控帶來了極大的麻煩，并且影響魚體美觀，銷售價格低下，因此給養殖戶帶來極大經濟損失，是水產養殖業的一重要瓶頸。

圖2 HSZJ01株 ITS基因序列與相關菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of HSZJ01 strain and its relatives

表1 菌株HSZJ01藥物篩選結果Tab.1 Antibiotic screening results

同樣隨著黃顙魚養殖業的迅猛發展，養殖過程中同樣病害頻發，使得黃顙魚養殖產業舉步維艱。近年來潰爛癥也時常在黃顙魚養殖過程中大規模爆發，主要癥狀仍然是體表潰爛，甚至爛穿漏出內臟，并造成死亡，逐漸成為黃顙魚養殖的一大危害。目前關于黃顙魚體表潰爛癥的報道也很多，但主要病原集中報道為溫和氣單胞菌[20]、擬態弧菌[21]以及維氏氣單胞菌[11]等，相關研究對黃顙魚體表潰爛癥的防控提供一定的參考意義。

本次浙江湖州出現黃顙魚體表潰爛癥，危害較大，主要癥狀與以往黃顙魚體表潰爛癥癥狀類似，但經臨床診斷及病原分離共純化獲得3株分離株，分別暫命名為HSZJ01、HSZJ02及HSZJ03。經浸泡人工感染試驗發現只有HSZJ01能夠使受傷黃顙魚出現潰爛癥，并可以從感染發病的黃顙魚潰爛體表再次分離到HSZJ01，表明HSZJ01為此次黃顙魚發病的病原。分子鑒定發現HSZJ01為不規則毛霉，是一種真菌，而黃顙魚暴發該病的溫度介于18～25 ℃之間，符合真菌發病條件，也佐證了分離株HSZJ01是黃顙魚此次體表潰爛癥的病原。 此次發現真菌導致黃顙魚發病的研究結果與鰻鱺腐皮病真菌病[9]存在一定的相似性。另本次黃顙魚發病與世界動物衛生組織(OIE)《水生動物衛生法典》所列的疫病流行性潰瘍綜合征[22]癥狀存在類似，但據病原學研究發現，本次黃顙魚發病是由不規則毛霉引起，而非絲囊霉菌，其進一步危害值得關注。

不規則毛霉分離于一例原發性皮膚病患者。最初被命名為多變根毛霉，但隨著近年來分子生物鑒定技術的迅猛發展，發現多變根毛霉在種系發生關系上與毛霉屬，尤其凍土毛霉具有最近的親緣關系，因此，2011年多變根毛霉被更名為不規則毛霉[23]。不規則毛霉主要引起人類繼發性皮膚感染病例，中國、澳洲、日本、美國及印度等均有病例報告。據文獻資料顯示，不規則毛霉為一種室外真菌，在全球都有分布，并且在土壤、動植物以及昆蟲腸道中廣泛存在[23]。此次發現黃顙魚感染不規則毛霉發病，在國內尚屬首次。

在水產養殖動物病害治療過程中，藥物仍然是重要的手段。本研究通過紙片擴展法，研究了5種抗生素以及6種消毒劑對分離菌株HSZJ01的抑菌效果，結果顯示抗生素中兩性霉素對HSZJ01抑菌效果最好，而消毒劑中硫酸銅抑菌效果最佳，因目前尚無水產動物源不規則毛霉的藥物敏感資料，因此只有參考人醫方面的數據，資料顯示不規則毛霉對兩性霉素敏感[23]，與本次實驗結果一致。此次藥物篩選可以為臨床防控提供一個參考，但在實際情況下，由于發病魚多食欲下降，口服療效差，采用消毒手段效果更佳。